侵染中国桑树的啤酒花矮化类病毒的致病性及其遗传多样性研究
侵染中国桑树的啤酒花矮化类病毒的致病性及其遗传多样性研究
【摘要】： 桑树(Morus alba L.)是具有重要经济效益和生态效益的木本植物,由于其常年生长在自然环境中,容易遭受多种病原物的侵染。啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid,HSVd)是马铃薯纺锤形块茎类病毒科(Pospiviroidae)啤酒花矮化类病毒属(Hostuviroid)中的成员,具有广泛的宿主范围。许多重要的经济作物(如啤酒花、桃、李、柑橘等)感染HSVd后产生明显的病害症状,造成重大的经济损失。尽管国外已有HSVd侵染桑树的报道,但我国作为桑树种植最大的国家,迄今为止还没有相关的报道。另外,HSVd对桑树的致病性及侵染中国桑树的HSVd群落的遗传多样性也缺乏研究。本研究利用HSVd最保守区域的序列设计通用引物,通过RT-PCR对桑园中有病毒或类病毒症状的桑树样品进行检测,首次确定了我国桑树存在HSVd的侵染,在此基础上,对该HSVd变种的致病性及种群的遗传变异进行了研究。1.HSVd在我国桑园中的发生与发生水平在镇江桑园中随机采集13个表现有类病毒样症状的桑叶样品,提取其ds RNA作为模板,以检测HSVd的通用引物进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测结果显示,其中1个样品扩增出约300 bp大小的条带;经克隆、测序结果显示,该片段大小为296 nt;经Blast分析,该序列与Gen Bank中HSVd序列具有最高的相似性,由此我们确定,我国桑园存在HSVd的侵染。根据获得的HSVd序列信息设计特异性引物,对桑园中40份桑树样品进行检测,其中3个样品呈HSVd阳性,该桑园桑树HSVd的感染率约为7.5%;序列相似性分析显示,中国桑树鉴定的4个HSVd变种间的序列相似性为99.7%-100%,与土耳其李的HSVd变种相似性最高,为96.68%,而与伊朗、意大利和黎巴嫩桑树HSVd变种的相似性较低,为93.6%-95.6%;系统进化分析显示,中国桑树鉴定的4个HSVd变种单独形成一个进化枝,与伊朗、意大利的HSVd分离株进化来源不同。2.HSVd的致病性通过构建农杆菌介导的HSVd c DNA侵染性克隆研究我国桑树上鉴定的HSVd对桑树及草本植物黄瓜、番茄的致病性。结果显示:构建的侵染性克隆能够侵染桑、黄瓜和番茄;黄瓜在接种后第32天,HSVd检测阳性率为17.64%,受侵染的黄瓜未表现出任何类病毒症状;番茄在接种后40天,HSVd检测阳性率为66.67%,部分受侵染的番茄表现有矮化症状;而桑则在接种后的第60天检测到1个样品呈阳性,78天后,HSVd检测阳性率达最高,为45.45%,受侵染的桑树的叶部未表现出任何类病毒症状,是否表现矮化症状需要更长时间的观察。3.HSVd群体遗传进化分析分析来自自然感染桑树(4个分离物60个克隆)、农杆菌接种呈HSVd阳性桑树(4个分离物60个克隆)和番茄(4个分离物59个克隆)的12个分离物共179个克隆,探讨中国桑树中鉴定的HSVd的遗传多样性和种群结构。HSVd种群核苷酸序列的相似性及位点差异分析显示:所有克隆的核苷酸序列的相似性为97-100%;179个分离物中存在111种HSVd的变种序列,变异位点主要在致病区和可变区;一个分离物中存在多种具有相关遗传性的异质序列(突变云)显示HSVd是一个准种。遗传多样性与进化分析显示:接种番茄中HSVd种群核苷酸多样性(P_i)和单倍型多样性(H_d)最高,分别为0.00553和0.831,该HSVd群体具有最丰富的遗传多样性;接种桑树中HSVd种群的P_i和H_d最低,分别为0.00249与0.583,该HSVd群体遗传多样性最低;自然感染桑树中HSVd种群的P_i和H_d分别为0.00413和0.727,该HSVd群体遗传多样性居于前二者之间。突变率分析显示,接种番茄中HSVd的突变率为1.37×10~(-3),接种桑树中HSVd的突变率为0.73×10~(-3),说明HSVd在非自然宿主中的进化速度要快于在自然宿主中的进化速度,可能是HSVd适应不同的复制机制的结果。这些发现为建立中国桑树HSVd特异性的检验检疫体系,生产健康无毒的商品桑苗、阻断HSVd的传播提供科学的依据,为进一步开展HSVd的致病性研究及HSVd致病的分子机制研究奠定了基础,具有重要的理论和实际应用价值。
【学位授予单位】：江苏科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2022
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