首页 > 分享 > 一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的建立方法及其用途

一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的建立方法及其用途

花匠小妙招
2024-12-12 04:06

本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种可以用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞损伤模型的建立方法及其用途。

背景技术：

1、近年来，中国已成为世界第二大化妆品市场，消费者对化妆品的诉求已不再是单一的安全性，而是安全性与功效性两者缺一不可，然而，我国在化妆品功效评价研究领域仍存在诸多短板，部分功效宣称对应的评价方法还不够完善。由于空气污染、紫外辐射、长期佩戴口罩、工作生活压力、过度化妆、刺激性食物等影响因素，我国敏感性皮肤人群的比例逐渐增加。与此同时，市面上以“舒缓”作为功效宣称的化妆品也层出不穷。敏感皮肤的特性决定了相应人群在选择护肤品时应当尽可能舒缓功效化妆品。根据敏感皮肤的形成机制，舒缓化妆品主要从修复皮肤屏障功能、抑制皮肤炎症反应、镇静过度神经反应这三种主要途径达到护肤效果，评价方法多为人体试验法和细胞生物法。人体试验法的志愿者样本量较少且存在个体差异性，成本较高。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的建立方法及其用途，利用高渗脱水法建立hacat体外细胞损伤模型，模拟由于外界因素而使皮肤失水导致屏障功能紊乱受损的生理状态，并利用此模型评价几种宣称具有修复屏障功能的化妆品舒缓功效原料，成本低，方法简单易操作。

2、本发明的技术方案：

3、一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的建立方法，包括如下步骤：s1、高渗处理hacat细胞；

4、取一瓶生长状态良好的hacat细胞，润洗、消化、离心、重悬、稀释后进行细胞计数，将原细胞悬液稀释成目标浓度约为8×104cells/ml的细胞悬液，按照事先设计的点样顺序在孔板中进行细胞铺板，培养；

5、s2、用cck-8法进行细胞活性检测；

6、s3、用显微镜观察细胞形态变化；

7、s4、用elisa法检测细胞表达透明质酸ha判断检测物对细胞损伤是否具有修复作用。

8、优选的，s1培养方法为：组别设置包括空白组、对照组、高渗损伤组、修复组和检测组，每组3-8个平行实验；

9、空白组和对照组培养24h后，吸出原培养液，按完全培养基添加培养液。继续培养16h后，吸出原培养液，按完全培养基添加培养液。培养4h后，吸出原培养液，更换为完全培养基，恢复培养2h后进行后续检测；

10、高渗损伤组培养24h后，吸出原培养液，按完全培养基添加培养液，继续培养16h后，吸出原培养液，按完全培养基和完全培养基质量0.5％ nacl添加培养液，培养4h后，吸出原培养液，更换为完全培养基，恢复培养2h后进行后续检测；

11、修复组培养24h后，吸出各孔原培养液，按完全培养基和完全培养基质量1％海藻糖添加培养液，继续培养16h后，吸出原培养液，按完全培养基和完全培养基质量0.5％nacl添加培养液，培养4h后，吸出原培养液，更换为完全培养基，恢复培养2h后进行后续检测；

12、检测组培养24h后，吸出原培养液，按完全培养基和待检测原料添加培养液，继续培养16h后，吸出各孔原培养液，按完全培养基和完全培养基质量0.5％ nacl添加培养液，培养4h后，吸出原培养液，更换为完全培养基，恢复培养2h后进行后续检测。

13、优选的，s2中进行细胞活性检测方法为：根据所选cck-8试剂的说明书操作步骤，在细胞每孔中加入10μl cck-8溶液，继续培养1～2h，使用酶标仪于450nm处测量od值，记录数据，后续进行数据的处理分析及作图。

14、优选的，数据的处理方法为：

15、使用graphpad prism 8.0软件进行统计分析，每个实验至少重复三次，每次实验至少3个重复值，所有数据均用mean±sem表示，两组间比较采用独立样本t检验，p<0.05为差异有显著性意义；

16、高渗损伤组细胞活率(％)：

17、修复组细胞活率(％)：

18、检测组细胞活率(％)：

19、ht组细胞活率在50％～70％，高渗损伤建模成功；与ht组相比，pc/tc组细胞活率显著性上调，p＜0.05，海藻糖、待检测原料保护/修复成功。

20、优选的，s4检测细胞表达透明质酸ha的方法为：

21、2-8℃收集细胞上清液，1000×g离心15min去除沉淀物，短时间内检测将细胞上清液样本存放于-20℃冰箱，长期保存于-80℃冰箱内；细胞上清液用于后续的elisa试验；根据elisa试剂盒说明书对细胞上清液中的透明质酸含量进行检测，获得样本中的透明质酸浓度。

22、优选的，s4判断检测物对细胞损伤是否具有修复作用方法为：若皮肤的透明质酸流失，则皮肤的水分也会跟着透明质酸而散失，根据对照组、高渗损伤组、修复组、检测组细胞中ha含量下降或者上调变化判断待检测物对细胞损伤是否具有修复作用。

23、优选的，所述完全培养基为：质量分数89％的赛默飞细胞培养基+质量分数10％胎牛血清+质量分数1％青链霉素；

24、检测组培养24h后，吸出原培养液，完全培养基和待检测原料按照不超过其质量2％添加培养液。

25、优选的，一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的用途，评估化妆品原料透明质酸钠的舒缓功效性；评估化妆品原料泛醇的舒缓功效性；评估化妆品原料马齿苋提取物的舒缓功效性；评估化妆品原料金盏花提取物的舒缓功效性。

26、本发明的有益效果：

27、目前，用于评估化妆品能否修复皮肤屏障功能的细胞损伤模型多采用紫外辐射、氧化应激、表面活性剂刺激等损伤方式，无法真实有效地模拟由于外界因素使皮肤失水导致屏障功能紊乱受损的生理状态。本发明对细胞的处理方式显著影响了角化包膜形成及表皮细胞分化，有效模拟人皮肤因脱水而导致的皮肤屏障功能紊乱受损的生理现象，所构建的体外细胞模型可用于评价化妆品原料/成品保护或修复皮肤屏障功能的有效性，评估化妆品原料/成品是否具有舒缓功效性。

技术特征：

1.一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、高渗处理hacat细胞；

2.根据权利要求1所述的一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的建立方法，其特征在于，s1培养方法为：组别设置包括空白组、对照组、高渗损伤组、修复组和检测组，每组3-8个平行实验；

3.根据权利要求2所述的一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的建立方法，其特征在于，s2中进行细胞活性检测方法为：根据所选cck-8试剂的说明书操作步骤，在细胞每孔中加入10μl cck-8溶液，继续培养1～2h，使用酶标仪于450nm处测量od值，记录数据，后续进行数据的处理分析及作图。

4.根据权利要求3所述的一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的建立方法，其特征在于，数据的处理方法为：

5.根据权利要求2所述的一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的建立方法，其特征在于，s4检测细胞表达透明质酸ha的方法为：

6.根据权利要求5所述的一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的建立方法，其特征在于，s4判断检测物对细胞损伤是否具有修复作用方法为：若皮肤的透明质酸流失，则皮肤的水分也会跟着透明质酸而散失，根据对照组、高渗损伤组、修复组、检测组细胞中ha含量下降或者上调变化判断待检测物对细胞损伤是否具有修复作用。

7.根据权利要求2所述的一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的建立方法，其特征在于，所述完全培养基为：质量分数89％的赛默飞细胞培养基+质量分数10％胎牛血清+质量分数1％青链霉素；

8.一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的用途，其特征在于，评估化妆品原料透明质酸钠的舒缓功效性；评估化妆品原料泛醇的舒缓功效性；评估化妆品原料马齿苋提取物的舒缓功效性；评估化妆品原料金盏花提取物的舒缓功效性。

技术总结
本发明涉及一种可用于评价化妆品舒缓功效的高渗脱水细胞模型的建立方法，包括如下步骤：S1、高渗处理HaCaT细胞；取一瓶生长状态良好的HaCaT细胞，润洗、消化、离心、重悬、稀释后进行细胞计数，将原细胞悬液稀释成目标浓度约为8×10<supgt;4</supgt;cells/mL的细胞悬液，按照事先设计的点样顺序及培养方式在孔板中进行细胞铺板，培养；S2、用CCK‑8法进行细胞活性检测；S3、用显微镜观察细胞形态变化；S4、用ELISA法检测细胞表达透明质酸HA判断检测物对细胞损伤是否具有修复作用。本发明用途用于评估化妆品原料透明质酸钠、泛醇、马齿苋提取物和金盏花提取物的舒缓功效性；本发明有效模拟人皮肤因脱水而导致的皮肤屏障功能紊乱受损的生理现象。

技术研发人员：刘蕾,何聪芬,贾焱,谭淇丹,宋丽雅,成志伟,董坤
受保护的技术使用者：北京工商大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/22