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【LorMe周刊】菌丝际细菌协助植物共生真菌适应土壤高铵环境

花匠小妙招
2024-12-12 15:23

际作者：徐浩，南京农业大学博士在读，主要研究根际微生物与植物的互作效应。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍植物共生真菌枫香拟茎点霉（Ph. Liquidambaris）与其菌丝际内肠杆菌SZ2相互作用以及SZ2促进Ph. Liquidambaris在富铵土壤中菌丝扩展和根部定殖的机制，原文于2023年发表在《ISME Journal》上。

导读真菌菌丝向根际区域的菌丝扩散速度决定了共生起始的过程。然而，土壤真菌经常暴露在异质环境中，包括微捕食者的攻击、有毒物质和不良的营养条件，这阻碍了植物-真菌相互作用的建立。为了适应这些环境，土壤真菌已经发展出一套多样化的防御策略，包括将特定细菌招募到菌丝际中。氮肥施用导致土壤中NH4+/NO3-比例较高，限制了土壤真菌的生长和菌丝扩散，导致植物-真菌共生减少。考虑到菌丝际细菌与宿主真菌建立了密切的关系，人们对了解这些细菌是否以及如何提高共生真菌对铵的耐受性非常感兴趣。腐生真菌拟茎点霉属（Phomopsis spp）广泛分布在土壤中并有助于生态系统功能。前人研究已发现植物共生真菌（枫香拟茎点霉）Phomopsis Liquidambaris与水稻（Oryza sativa L.）建立了有益的联系，并促进富含NH4+的水稻土中的氮获取和植物生长。在本研究中，假设Ph. Liquidambaris在其菌丝际中富集了特定的微生物，作为适应富含NH4+的条件的手段，从而成功地到达根际进行定殖。主要结果高NH4+:NO3−比抑制Ph. liquidambaris菌丝生长并阻碍其在土壤中的传播将Ph. Liquidambaris 接种在具有不同NH4+/ NO3-比例的改良矿物盐培养基上生长7天后发现随着NH4+比例提高菌丝生长受到抑制加剧（A），对其结构进行观察发现高NH4+比例下的菌丝结构混乱（B）。同时，高NH4+溶液的灭菌土壤上琼脂块捕获的菌丝生长在从D1（0.5 cm）到D3（2.5 cm）逐渐变弱（C）。

图1 Ph. liquidambaris对富NH4+的环境（高 NH4+:NO3- 比率）敏感。 土壤微生物促进Ph. Liquidambaris 适应富含NH4+的环境将Ph. Liquidambaris分别接种在、自然土以及预接种Ph. Liquidambaris 3天自然土的处理中，发现在灭菌土处理中距离接种点超过 20 mm 的地方没有检测到Ph. Liquidambaris，而在土壤微生物存在的情况下，真菌菌丝体可达到 20-25 mm（A）。同时，用Ph. Liquidambaris进行土壤预接种后，菌丝体可以在根际土壤中检测到，并可在根表面观察到（B-D）。

图2 土壤微生物协助Ph. liquidambaris扩散到水稻根际并在富NH4+的条件下定殖。肠杆菌在 NH4+ 敏感的WT菌丝际富集，但在 NH4+偏好的Δnir菌丝际耗尽作者构建了亚硝酸还原酶缺陷株Δnir，其在高NH4+环境下生长良好而在高NO3-环境下生长受到抑制。并通过测定天然土壤（NS）、WT和Δnir 菌丝际土壤中细菌16S rRNA的相对丰度发现WT菌丝际比天然土壤含有更多的细菌16S rRNA相对丰度。

图3 Δnir是WT的亚硝酸还原酶缺陷株，且WT菌丝际比天然土壤含有更多的细菌16S rRNA相对丰度。PCoA表明，NS、WT和Δnir菌丝际内的细菌群落形成了三个不同的簇（A）。同时，与NS相比，WT和Δnir菌丝际内的细菌群落丰富度和香农指数较低（B）。对不同处理之间相对丰度显著不同的细菌科（C）和属（D）进行分析发现肠杆菌科（Enterobacteriaceae）肠杆菌属（Enterobacter）在WT菌丝际中显示出较高丰度（特别是ASV1558）但在Δnir菌丝际中显示出较低丰度（E）。基于半选择性培养基从 WT 菌丝际土壤中分离出候选肠杆菌，在评估了候选肠杆菌对真菌渗出物的生长和趋化反应后，选择了SZ2进行进一步研究。此外，SZ2与ASV1558具有99.8%的序列相似性。

图4 肠杆菌属细际在NH4+敏感的 WT 菌丝圈中富集，但在NH4+偏好的 Δnir 菌丝际中耗尽。Ph. liquidambaris和肠杆菌SZ2之间的有益相互作用平板试验结果表明，SZ2与WT近距离共接种可促进其生长（A）。同时，电镜观察表明在共培养过程中，WT和SZ2相互吸引（B-C），且WT和SZ2在共接种后2（D）、4（E）和6（F）天可以在没有生长抑制的情况下共同生活。

图5 Ph. Liquidambaris 和代表性肠杆菌分离株 SZ2 的共接种。土壤试验结果表明，与未接种条件相比，接种WT土壤中SZ2显著增加，但Δnir 接种则没有显著增加（A）。同时，WT分泌物显著促进SZ2的生长、生物膜形成、细胞游动和SZ2的集群运动（B-E），且WT分泌物（图7）提高了参与细胞分裂（ftsA，ftsZ）、生物膜形成（wcaB）和卷曲菌毛形成（csgF）基因的表达水平。在7 天时，如果没有接种WT，则没有观察到菌丝（F），相反，WT沿着土壤表面广泛延伸（G，H）并发现大量SZ2 附着在菌丝表面（I，J，K）。

图6 Ph. Liquidambaris-Enterobacter sp. SZ2 的交互分析。

图7 WT分泌物对SZ2细胞分裂（ftsA，ftsZ）、生物膜形成（Wza，wcaB）和卷毛菌毛形成（csgF）相关基因表达的影响。 作者为了探究WT菌丝际对SZ2的吸引过程，进行了平板毛细管试验，结果表明与琼脂或Mock处理相比，WT菌丝体吸引更多的SZ2细胞进入毛细管（A-B）。荧光显微镜进一步详细描述了真菌-细菌相互作用：大量的SZ2细胞通过已建立的毛细管通道附着在菌丝表面的A位点（C），然后，SZ2细胞迁移到未接种的B位点（D），表明SZ2沿着菌丝表面扩散（E-G）。

图8 WT分泌物对SZ2的引诱作用。 SZ2并未直接增强WT对高NH4+的耐受性如图A所示，SZ2的分泌物在具有5∶1的NH4+：NO3-的液体MSM中生长时，不会显著促进WT的生长。同时，与SZ2共接种不会影响WT菌丝中铵转运蛋白的相对表达量（B-C）。

图9 SZ2对WT在富含 NH4+条件的生物抗性的影响。SZ2通过影响依赖于土壤微生物合作的菌丝际微环境，增强了WT对高NH4+ 的耐受性如图11A所示，富含肠杆菌的WT菌丝际表现出明显较低的 NH4+/NO3−比率，而Δnir 菌丝际则表现出比天然土壤更高的NH4+/NO3−比率。同时，肠杆菌的相对丰度与NH4+/NO3−比率的降低呈正相关，从而促进菌丝扩散（B-C）。当NH4+/NO3−比例增加时，SZ2的生长受到抑制，表明对NH4+胁迫高度敏感，这与WT菌株相似（D）。此外，高NH4+/NO3−比率降低了菌丝际和土体土壤中SZ2的丰度，但更多的SZ2被吸引到菌丝际区域，表明高NH4+/NO3−比率驱动WT-SZ2 相互作用（E），而SZ2接种仅在非灭菌条件下增加了WT的菌落直径（F）。

图10 SZ2 通过降低菌丝际NH4+:NO3−比率来增强WT对NH4+富集条件的适应。氨氧化微生物参与 SZ2 增强WT对高NH4+ 的耐受性与Δnir相比，WT菌丝圈土壤中的NH4+水平低，NO3−水平较高（A-B），这表明菌丝际SZ2很可能招募氨氧化剂，包括氨氧化古菌（AOA）和细菌（AOB），它们有助于NH4+转化。但AOB的amoA基因丰度在处理之间没有显示差异（C），这表明可能与氨氧化古菌有关。

图11 NS、WT 和 Δnir 菌丝土壤中NH4+-N（A）和NO3--N（B）的含量以及氨氧化细菌（AOB）的丰度（C）。对AOA进行测定结果表明WT 菌丝际中的 AOA amoA 基因丰度显著高于未接种处理（A）。同时，AOA amoA基因的相对丰度与肠杆菌的相对丰度和NH4+:NO3−比率的降低呈正相关（B-C）。香芹酚油（CAO）通过减少菌丝表面上的 SZ2 细胞数量来抑制与WT相互作用（D）。在土壤环境中，与CAO共处理以及ATU或NRP的外源应用会损害WT以及WT和SZ2接种降低的NH4+:NO3−比率以及增强的真菌生长（E-F）。SZ2的存在显著增加了 AOA amoA基因丰度。此外，与SZ2共接种显着增加了Δnir接种土壤中AOA的丰度（G）。PCoA揭示了未接种土壤、WT和Δnir接种土壤中AOA群落组成存在显著差异（H）。相比之下，Δnir与SZ2共接种或WT与CAO共接种消除了WT和Δnir接种土壤之间AOA群落组成的差异。与天然土壤相比，WT和SZ2接种的土壤有较高的AOA香农指数，外源CAO损害了WT增加的AOA香农指数（I），表明WT通过丰富菌丝际肠杆菌影响AOA群落。

图12 氨氧化古菌（AOA）被SZ2吸引并共同参与降低WT菌丝际中的NH4+:NO3−比率。 SZ2 可以与其他NH4+ 敏感真菌建立有益的相互作用从水稻根际分离筛选了NH4+敏感、耐受或偏好的代表性真菌菌株（A）。共培养结果表明（B-C），SZ2可以与其他NH4+敏感真菌建立有益的相互作用，但不能与NH4+耐受性或NH4+偏好性真菌建立有益的相互作用。

图13 SZ2与从水稻根际土壤中分离出代表性的腐生真菌建立多种相互作用关系，对富含 NH4+的条件具有不同的反应。WT和SZ2相互作用促进水稻在富含NH4+的水稻土中生长图A表明SZ2可以被水稻根部分泌物以及根部和菌丝分泌物的混合物吸引，同时Ph. Liquidambaris和SZ2能够在水稻根部共生（B）。在富含 NH4+的土壤中，SZ2 接种显著增加了根际AOA amoA基因的丰度，而与 WT 共接种则进一步增强了这些效应（C）。与未接种处理相比，SZ2接种不影响灭菌土壤中水稻的生长（D）。在未灭菌的土壤中（E），接种WT显著增加了水稻根长、地上部长度和幼苗鲜重；与未接种处理相比，接种SZ2显著增加了水稻根长，而与WT共接种则进一步增强了这些效应。

图14 Ph. Liquidambaris-SZ2共接种可增加水稻根际氨氧化古菌（AOA）的丰度并促进植物生长。结论研究揭示了一种植物共生真菌在其菌丝际中富集特定细菌，从而使细菌招募氨氧化微生物，进而适应富NH4+环境并最终促进根-真菌相互作用的机制。首先，在富NH4+环境，肠杆菌SZ2定殖于Ph. Liquidambaris的菌丝际中，其中菌丝分泌物能够促进肠杆菌SZ2的生长。其次，肠杆菌SZ2能够驱动氨氧化古菌（AOA ）降低环境NH4+:NO3−比率并通过与Ph. Liquidambaris之间的合作减轻NH4+胁迫障碍来促进菌丝传播。最后，Ph. Liquidambaris 到达根际并在根部定殖，增强根际氮素转化并促进植物的生长发育。研究为有益真菌及其菌丝际细菌的实际组合以提高营养胁迫地区植物-真菌共生效率提供了理论基础。