GhACBP4在棉花花药发育中的功能鉴定
【摘要】： 近年来,全球变暖引发的区域性高温是导致农作物雄性不育的重要因素之一,并且严重威胁农业生产。研究表明GhCKI在响应高温导致棉花雄性不育方面具有重要功能,因此为了进一步解析高温胁迫导致棉花雄性不育的败育机理,通过酵母双杂筛选出与GhCKI互作的GhACBP4(acyl-CoA-binding protein 4)蛋白,并且从超表达GhCKI拟南芥花蕾和棉花H05(高温敏感型)花药的磷酸化蛋白质组中筛选出3种ACBP4的磷酸化肽段。因此,本研究主要解析GhACBP4在花药中的功能,主要结果如下:1、经过序列分析发现,在陆地棉基因组中GhACBP4存在6个同源基因。组织表达模式分析表明Gh_A13G0893/Gh_D13G1134在花药中优势表达。然而转基因材料proGh_A13G0893::GUS的组织表达模式表明,该基因在花药、胚珠和萌发后的种子中高量表达。而且,高温诱导表达模式分析表明,在花药开裂期(ADS,>24mm花蕾)GhACBP4同源基因总体的表达量受高温诱导后可能会下调表达。2、综合比较6个同源基因的表达水平和3种磷酸化肽段,选取Gh_A13G0893做进一步的功能研究。在超表达Gh_A13G0893和Gh_A13G0893-3’UTR-RNAi特异干涉棉花材料中,都出现了雄性不育的表型。在Gh_A13G0893-3’UTR-RNAi不育材料中GhACBP4的6个同源基因表达量均降低,可能与拟南芥acbp4acbp5突变体败育表型相一致。借助透射电镜观察超表达不育材料的花药,在绒毡层降解时期,小孢子内部缺乏淀粉和脂滴,内壁缺失,而且绒毡层中没有脂滴;在花药开裂期,花粉外壁没有含油层。3、相比野生型,超表达GhACBP4不育材料的花药中脂肪酸含量下降。并且野生型YZ1和H05的花药中脂肪酸的含量受高温胁迫后也发生显著变化。利用薄层层析发现,在超表达GhACBP4不育材料的花药和高温诱导H05的花药中,脂质的含量也显著变化。这些结果表明超表达GhACBP4不育的表型同高温诱导野生型败育的表型具有相似性。4、为了验证GhCKI和GhACBP4是否存在互作,并了解它们发生互作的位置,通过酵母双杂、双分子荧光互补实验和双分子荧光素酶互补实验发现,GhCKI和GhACBP4存在互作,同时这两个蛋白共定位于过氧化物酶体中。然而,如果将GhACBP4蛋白的501和517氨基酸位点由丝氨酸(S)突变为甘氨酸(A)后,含有501位点突变的GhACBP4就不能与GhCKI发生互作,但含有517位点突变的GhACBP4与GhCKI仍有微弱互作。5、在原核表达过程中发现,带有His标签的GhACBP4蛋白可能具有多种磷酸化修饰状态,进而无法在体外被GhCKI磷酸化。6、经过综合分析,推测GhACBP4过量表达会激活GhCKI转录,导致大量GhACBP4蛋白被GhCKI磷酸化;而GhACBP4的活性可能降低,或被降解。当GhACBP4转录水平受到抑制,其蛋白水平也降低。并且,在高温诱导条件下,这两种情况可能同时存在。因此,这可能造成过氧化物酶体中脂质转运发生异常,最终导致花粉败育。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
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