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RAP基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法.pdf

花匠小妙招
2024-12-13 23:42

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911206509.0 (22)申请日 2019.11.29 (71)申请人华中农业大学地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号 (72)发明人康春颖高绮骆慧枫 (74)专利代理机构北京轻创知识产权代理有限公司 11212 代理人冯瑛琪 (51)Int.Cl. C12N 9/10(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/08(2018.01) A01H 6/74(2018.01)。

2、 (54)发明名称 RAP基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法 (57)摘要本发明涉及RAP基因过表达在改变草莓果实颜色中的应用,通过在白果草莓植株中过表达 RAP基因得到红果草莓。本发明还提供了一种改变草莓果实颜色的育种方法，包括在白果草莓植株中过表达RAP基因的步骤。本发明提供了RAP基因在草莓颜色育种中的新应用，并且利用RAP基因过表达开发了一种促进草莓果实着色的新方法。权利要求书1页说明书9页附图4页 CN 110819603 A 2020.02.21 CN 110819603 A 1.RAP基因过表达在改变草莓果实颜色中的应用，其特征在于，通过在。

3、白果草莓植株中过表达RAP基因得到红果草莓。 2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述草莓为森林草莓。 3.一种改变草莓果实颜色的育种方法，其特征在于，包括在白果草莓植株中过表达RAP 基因的步骤。 4.根据权利要求3所述的一种改变草莓果实颜色的育种方法，其特征在于，在白果草莓的愈伤组织中过表达RAP基因，并将所述愈伤组织培育成植株。 5.根据权利要求4所述的一种改变草莓果实颜色的育种方法，其特征在于，在白果草莓的愈伤组织中过表达RAP基因的方法为：通过gateway反应将RAP基因整合到过表达载体 pK7WG2D中，并将整合有RAP基因的过表达载体pK7WG。

4、2D-RAP转入白果草莓的愈伤组织中。 6.根据权利要求5所述的一种改变草莓果实颜色的育种方法，其特征在于，通过农杆菌转化法将所述整合有RAP基因的过表达载体pK7WG2D-RAP转入白果草莓的愈伤组织中。 7.根据权利要求3-6任一项所述的改变草莓果实颜色的育种方法，其特征在于，所述草莓为森林草莓。权利要求书 1/1 页 2 CN 110819603 A 2 RAP基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法技术领域 0001 本发明涉及草莓育种技术领域，具体的，涉及RAP基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法。背景技术 0002 草莓(Fragaria ananass。

5、a)为蔷薇科草莓属多年生草本植物，具有丰富的营养价值，位居世界小浆果生产之首。果实色泽是草莓育种的重要目标之一，而花青素是草莓果实变红的主要色素。植物细胞以苯丙氨酸为前体，在细胞质中经多步酶促反应合成花青素并储存于液泡中。花青素生物合成受两类基因的控制，分别称为结构基因和调节基因，其中结构基因在花青素合成途径中编码了一系列生物合成酶，且合成途径在各物种中非常保守，大致分为以下阶段：第一阶段前体苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶 (C4H)、 4香豆酰辅酶A连接酶(4CL)的作用下转化成4-香豆酰CoA；第二阶段是4-香豆酰CoA 和丙二酰。

6、CoA在查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄烷酮 3 -羟化酶(F3 H)的作用下合成二氢黄烷醇；第三阶段是在二氢黄酮醇还原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)、类黄酮糖基转移酶(UFGT)的作用下生成花青素。其中黄酮醇合酶(FLS)作为一个分支途径可将二氢黄烷醇形成黄酮醇，无色花色素还原酶(LAR)和花青素还原酶 (ANR)可催化原花青素的形成。 0003 花青素合成途径的结构基因主要受到调节基因在转录水平上的调控，其中研究最透彻的是R2R3-MYB转录因子、 bHLH转录因子和WD40重复蛋白三者组成的复合体，称为 “MBW。

7、” (MYB-bHLH-WD40)复合体。例如， R2R3-MYB转录因子MYB10在苹果、桃、油桃、樱桃和梨中均调控了果实颜色。在草莓中，多篇文章证实Fa/FvMYB10是正向调控果实颜色的关键转录因子，并且FvMYB10与FvbHLH33可能形成复合体促进结构基因的转录。最新研究发现因自然突变引起FvMYB10第12位氨基酸从W变为S，导致不同草莓生态型间红果(如Ruegen)和白果(如 YellowWonder、 Hawaii 4)的差异。具体来说，野生型白果森林草莓 YellowWonder (YW)和 Hawaii4 (H4)均有红色叶柄、淡黄色的果皮、。

8、白色的果肉和瘦果；相反，野生型红果森林草莓 Ruegen 具有红色叶柄、红色的果皮、白色的果肉和红色的瘦果，且果皮和瘦果着色是从果实发育后期的转色期开始的。对于FveMYB10来说， Ruegen是一个真正的野生型，而 YellowWonder相当于该基因的缺失突变体。 0004 除受合成途径的调控外，花青素的修饰和运输也直接影响了花青素最终的积累水平。花青素的稳定性受到糖基化、甲基化和乙酰化等修饰的调控。花青素在细胞质合成后需要运输到液泡中储存，因此花青素的运输也是调控花青素积累的重要环节。以玉米ZmMRP3 为代表的MRP，以拟南芥TT12为代表的MAT。

9、E，以及谷胱甘肽S-转移酶(GST， glutathione S- transferase)都具有运输花青素的作用。不同物种中的GST蛋白都可作为搬运蛋白 (carrier)介导花青素的运输过程，如矮牵牛的AN9基因、玉米的BZ2基因以及拟南芥的TT19 基因，其功能缺失后植株所有组织的花青素含量都显著下降。在桃中， GST编码基因Riant调控了桃花杂色。此前， Luo et al.，通过ENU诱变YellowWonder获得一个具有绿叶叶柄的突说明书 1/9 页 3 CN 110819603 A 3 变体rap，但它实际上是rap myb10双突变体。基因克隆结果表。

10、明RAP编码GST蛋白，是草莓营养器官和果实着色的关键转运蛋白。现有结果表明，在草莓果实成熟过程中， FveMYB10诱导花青素合成酶和RAP基因大量表达，从而引起花青素积累，使果实着色；据此推断在 FveMYB10缺失情况下，由于花青素合成受阻， RAP基因过表达也不会使白果草莓着色。发明内容 0005 发明人意外地发现将RAP基因连接到过表达载体PK7WG2D上，并稳定转化于RAP基因突变的白果森林草莓突变体中，果实颜色变红。 0006 基于此，本发明提供了RAP基因过表达在改变草莓果实颜色中的应用，通过在白果草莓植株中过表达RAP基因得到红果草莓。 000。

11、7 进一步，所述草莓为森林草莓。 0008 本发明还提供了一种改变草莓果实颜色的育种方法，包括在白果草莓植株中过表达RAP基因的步骤。 0009 进一步，具体步骤为在白果草莓的愈伤组织中过表达RAP基因，并将所述愈伤组织培育成植株。 0010 进一步，在白果草莓的愈伤组织中过表达RAP基因的方法为：通过gateway反应将 RAP基因整合到过表达载体pK7WG2D中，并将整合有RAP基因的过表达载体pK7WG2D-RAP转入白果草莓的愈伤组织中。 0011 进一步，通过农杆菌转化法将所述整合有RAP基因的过表达载体pK7WG2D转入白果草莓的愈伤组织中。 0012 进一。

12、步，所述草莓为森林草莓。 0013 本发明的有益效果是：本发明提供了RAP基因在草莓颜色育种中的新应用，并且利用RAP基因的过表达开发了一种促进草莓果实着色的新方法。附图说明 0014 图1为本发明不同森林草莓的植株、花和心皮的形态，其中(a)、 (b)(c)、 (d)分别为 YW5AF7、 rap、 RAP-ox； rap和Ruegen的植株、花和心皮的形态，其中心皮的标尺为20 m，图(e) 为rap以及RAP-ox； rap叶柄的表皮和横切图； 0015 图2为本发明不同森林草莓果实照片，其中(a)、 (b)(c)、 (d)分别为YW5AF7、 rap、 RAP-o。

13、x； rap和Ruegen成熟果实的表型，标尺为3mm； 0016 图3为本发明YW5AF7、 rap、 RAP-ox； rap和Ruegen的叶柄以及果实中花青素的含量图； 0017 图4为本发明YW5AF7和RAP-ox； rap叶柄和果实中花青素的HPLC色谱图，其中图4 (a)为叶柄中花青素的色谱图，图4(b)为果实中花青素的色谱图，其中x轴表示时间， y轴表示在510nm处的吸光度，峰1为矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷，峰2为芍药素-3,5-二葡萄糖苷，峰3为矢车菊素-3-葡萄糖苷，峰4为天竺葵素-3-葡萄糖苷，峰5为芍药素-3-葡萄糖苷，峰6 为矢车菊素衍生物。

14、，峰7为天竺葵素衍生物，峰8为芍药素衍生物，峰9未知； 0018 图5为RAP-ox； rap和Ruegen不同发育阶段花或果实的颜色，其中图5(a)Ruegen不同发育阶段花和果实的纵切图，图5(b)RAP-ox； rap不同发育阶段花和果实的纵切图，其中说明书 2/9 页 4 CN 110819603 A 4 分别有阶段9(S9)、 10(S10)、 12(S12)及开花期(Anthesis)、授粉后第6天(6d)、第10天 (10d)、第13天(13d)及转色期(Turning)的果实，比例尺分别为250m(S9， S10， S12， Anthesis)， 1mm。

15、(6d， 10d， 13d)及1cm(Turning)； 0019 图6为在YW5AF7果实中瞬时过表达RAP后果实的颜色，其中图6(a)为在YW5AF7果实中注射缓冲液的对照组,图6(b)为在YW5AF7果实注射含有RAP过表达载体的农杆菌重悬液； 0020 图7为RAP-ox； rap和Ruegen植株开花期和转色期的转录组分析结果，其中图7(a) 为Venn图显示RAP-ox； rap和Ruegen果实转色期与开花期(S1)相比的上下调基因数量，图7 (b)为在开花期(S1)RAP-ox； rap与Ruegen相比上调和下调的基因数量， Fold change2, padj0.0。

16、5，图7(c)为RNA-seq数据显示RAP和其他7个花青素生物合成相关基因的表达水平，其中Ruegen-S1代表Ruegen的开花期， RAP-ox； rap-S1代表RAP-ox； rap的开花期， Ruegen-Turning代表Ruegen的转色期， RAP-ox； rap-Turning代表RAP-ox； rap的转色期。具体实施方式 0021 以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。 0022 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，如sambrook等分子克隆实验手册(Sambro。

17、ok J&Russell DW， Molecular cloning:a laboratory manual,2001),或按照生化试剂制造厂商的说明书建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 0023 本发明中使用的植物材料为： 0024 野生型白果森林草莓(Yellow Wonder， YW5AF7， National Clonal Germplasm Repository:Corvallis,OR,USA,ID PI641092)； 0025 野生型红果森林草莓(Ruegen， National Germplasm Repository 。

18、ID PI666609)； 0026 对野生型白果森林草莓的RAP基因突变得到的突变体rap，其RAP基因的第245位核苷酸由C突变为T，导致RAP提前终止，无法表达RAP蛋白。该突变体rap是由本实验室中通过 ENU诱变得到，也可以通过基因编辑方法获得RAP基因突变的突变体rap。 0027 用于实验的材料均在温度为22，光照为100 mol m-2s-1，光周期为16h light/ 8h dark的植物培养间中生长。 0028 RAP基因编码一种谷胱甘肽S-转移酶(GST)，其为将合成的花青素从细胞质转移到液泡中的载体蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：。

19、 0029 atggtactgaaagtttatggtccagttagggcagcctgcccccagagggtgatggtttgccttttgga gctaggggttgagtttgagattgtgcctgttgatcttcaagcaggagagcaaaagcaacctcacattcttgctcga caggtaaatattaacagtctagcaacataattgcatcaaattacacacacatacatgtcggcatatatttgactgt ttgattaatttgcagccatttgggcaagttccagcaatcgaagatggcgatttcaagctttttggtatggg。

20、gggat gatatgcatacatacatatacttgttactttcttaatttgggtcttttttggaagtccatgaaaaaagtagtcctt gcaaaaatggcaataacaatatcagcagttgaaattgtgaaccaagtccaaaatgttattgataattggttatcaa gagattaactagctaggtataactagtatagtaatactgtacgtatcttggaataagatgttcaaagttcttgttg ctgtatgccttcattaacccgatttctggctctcgctctgctacacagaatctagagctatcg。

21、taagatactatgc ggctaagtatgcagagcgtggtcctaacctgctaggaacaacactggaggagaaggcactggtggatcaatggctc 说明书 3/9 页 5 CN 110819603 A 5 gaagtcgaatcacacaacttcaacgacttggttttcactgtggtacttcaacttgtgatccttcccagcatgggcc aacctggcgacttggccttggtgcgctcttgtgaagaaaaactgaaaaaggtattcgatgtgtatgaggagagact gtccaagagcacctatctggccggaa。

22、actacttcagtttggctgatctgagccatcttccggcgattcggtttctg gttgacgagttcaaaatgggacatttgatcacggagaggaagaatgtgaatgcttggtggaaagatatttccaata ggcctgcatggaagaaacttatgaagcttgctcaatactag 0030 其中标下划线的为内含子。 0031 1、 RAP基因过表达载体构建 0032 过表达载体构建：使用生工RNA提取试剂盒(B518661-0050，生工)提取野生型红果草莓Ruegen嫩叶的RNA,然后通过反转录试剂盒(PrimeScriptTM。

23、 RT reagent Kit with gDNA Eraser)将RNA反转录成cDNA，以Ruegen cDNA为模板在RAP基因的开放编码框两端设计引物并加上接头序列，扩增引物为： 0033 B1-Gene31672-F:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatggtactgaaagtttatggt(SEQ ID NO:2), 0034 Gene31672-RFP-R:aggaggccatgtattgagcaagcttcataagt(SEQ ID NO:3) 0035 扩增RAP的CDS序列(扩增体系为： KOD Plus Buf5 l、 dNTP 5 l、。

24、MgSO43.5 l、 Primer15 l、 Primer25 l、 KOD Plus 1 l、 DMSO2.5 l、 ddH2O 18 l、模板cDNA 5 l，反应条件： 945min， 9435s， 6035s， 68x min， 685min， 45min)，通过overlapping PCR与 RFP融合， RFP扩增引物序列为： 0036 Gene31672-RFP-F:tgctcaatacatggcctcctccgaggacgtc(SEQ ID NO:4)、 0037 B2-RFP-R： ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttaggcgccggt。

25、ggagtggcgc(SEQ ID NO:5) 0038 扩增片段总长1434bp，使用Cycle-Pure Kit(OMEGA)试剂盒纯化融合片段，通过BP 反应(反应体系： PCR产物10ng、 pDONR221中间载体质粒80ng、 BP酶0.6 l、 1TE buffer补齐至3 l反应条件： 25反应2h)将片段整合到中间载体pDONR221(质粒提取采用OMEGA的 Plasmid Mini Kit I试剂盒)上，通过PCR(引物F:atggtactgaaagtttatggt(SEQ ID NO:6)、引物R:gtattgagcaagcttcataag(SEQ ID NO。

26、:7)，大小642bp，反应程序： 2ES Taq MasterMix 9 l、 ddH2O 5 l、 Primer11 l、 Primer21 l、模板2 l，反应条件： 955min， 95 30s， 5530s， 723min， 727min， 45min)、 XbaI和KpnI-HF酶切(反应体系： Cutsmart 1 l、 XbaI(酶1)0.3 l、 KpnI-HF(酶2)0.3 l、 Plasmid 5 l、 ddH2O补齐至10 l，反应条件： 37 水浴3h)、测序(用擎科公司引物M13-F测序)鉴定阳性菌。通过LR反应(反应体系： RAP- pDONR221。

27、中间载体质粒50ng、 pK7WG2D终载体质粒50ng、 LR酶0.6 l、 1TE buffer补齐至3 l，反应条件： 25反应2h)将片段整合到过表达载体pK7WG2D(质粒提取采用OMEGA的 Plasmid Mini Kit I试剂盒)中，得到RAP基因过表达载体pK7WG2D-RAP，通过PCR(采用SEQ ID NO:6所示的引物F和SEQ ID NO:7所示的引物R)，大小642bp)验证、 XbaI酶切(反应体系： Cutsmart 1 l、 XbaI 0.6 l、 Plasmid 5 l、 ddH2O补齐至10 l，反应条件： 37水浴3h)验证后提取质粒转到。

28、农杆菌株GV3101(维地生物CAT#： AC1001)中， PCR阳性鉴定(采用SEQ ID NO:6所示的引物F和SEQ ID NO:7所示的引物R)，大小642bp)后保存备用。 0039 2、农杆菌介导的草莓稳定转化与鉴定 0040 下列步骤中用到的MS为购自北京西美杰的M404 Murashige&Skoog Modified 说明书 4/9 页 6 CN 110819603 A 6 Basal Medium with GamborgVitamins(Phytotech， M404-100L)。其中1/2MS为添加量为说明书指示浓度的1/2。 0041 采用农杆菌介导的森林草。

29、莓愈伤组织转化法，具体操作步骤如下： 0042 1)无菌苗的准备 0043 将突变体rap的种子放入试管中，加入无菌水，放入冰箱， 4浸泡过夜，次日，吸去无菌水，加入70酒精浸泡5min(摇晃)，用无菌水冲洗4-5次，将酒精去除干净，用2的次氯酸钠，加一滴Tween20，浸泡10min(摇晃)，用无菌水冲洗3-4次，将种子播在含1/2MS培养基(1/2MS 2.22g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L， pH 5.8)的培养皿上，在4下暗培养两周后转移到组培间发芽，当叶子长出2片真叶时移到1/2MS的瓶子中备用。 0044 2)培养愈伤组织 0045 在超。

30、净台中，用剪刀将无菌苗的叶片剪下，放在灭菌的空皿上，用手术刀切成若干小片(每小片叶子切3次)，放到5+培养基(MS 4.44g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+吲哚丁酸 0.3mg/L+6-苄氨基嘌呤3.4mg/L， pH5.8)上，每板放20片左右，并且叶片正面朝下， 22暗培养15-30d，直至切口长出愈伤组织。 0046 3)准备菌液 0047 蘸取-80保存的菌液于含有抗性的固体LB培养基(酵母膏5g/L+蛋白胨10g/L+ NaCl 10g/L+琼脂15g/L+庆大霉素50 g/ml+利福平50 g/ml+壮观霉素50 g/ml)上，划线活化农杆菌， 28培养。

31、2-3d，挑取单克隆抗体与4mL含有抗性的液体LB培养基(酵母膏5g/L+蛋白胨10g/L+NaCl 10g/L+庆大霉素50 g/ml+利福平50 g/ml+壮观霉素50 g/ml)中， 28震荡过夜， PCR鉴定阳性菌液。 0048 4)转化 0049 将菌液倒入2mL离心管中，取3-4管， 8000rpm离心2min，弃上清，取1mL Co-buffer (MS4.44 g/L+蔗糖20g/L,pH 5.8)重悬菌液，加入到含有20mL Co-buffer的三角瓶中，加入 200 l浓度为50mg/ml的乙酰丁香酮(AS)溶液，室温遮光摇3h后，加入3板愈伤组织，室。

32、温遮光轻摇0.5-1h，用无菌水清洗愈伤组织2-3次，用镊子夹到滤纸上，将水吸干，放到5+培养基上，叶片正面朝下，放入培养箱，遮光共培养3d。 0050 5)清洗愈伤组织 0051 共培养3d后，部分愈伤组织附近产生农杆菌，将愈伤组织夹到含有无菌水的三角瓶中，清洗2-3次，用滤纸吸干水分，放到CT培养基(MS 4.44g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+吲哚丁酸0.3mg/L+6-苄氨基嘌呤3.4mg/L+羧苄青霉素250mg/L+特美汀250mg/L,pH 5.8)上，放入培养箱黑暗处理1周后转到正常培养条件培养(培养箱：光照16h， 22，黑暗8h。

33、， 19)。 0052 6)继代培养 0053 在CT培养基上培养2周后，将愈伤组织转到抗性培养基(MS 4.44g/L+蔗糖20g/L+ 琼脂7g/L+吲哚丁酸0.3mg/L+6-苄氨基嘌呤3.4mg/L+羧苄青霉素250mg/L+特美汀250mg/L+ 卡那霉素5mg/L,pH 5.8)上，以后每2周至一个月换一次培养基，直至愈伤分化出芽。 0054 7)生根培养 0055 愈伤产生芽后，将芽从组织上切下，转移到生根培养基(1/2MS 2.22g/L+葡萄糖 20g/L+琼脂7g/L+吲哚丁酸0.1mg/L+羧苄青霉素200mg/L+特美汀200mg/L+卡那霉素5mg/L, p。

34、H 5.8)上培养，直至生根。说明书 5/9 页 7 CN 110819603 A 7 0056 8)阳性苗鉴定 0057 采用抗性培养基和GFP荧光筛选阳性愈伤和再生苗，小苗生根后种到土里，按照株系编号，采取嫩叶提取DNA，通过以卡那抗性基因引物Kam-F和Kam-R、 GFP基因引物GFP-F和 GFP-R以及目的基因引物RAP-F和RAP-R进行PCR鉴定得到稳定转化RAP基因的阳性苗。其中成功在突变体rap中过表达RAP基因的植株为RAP-ox； rap。 0058 其中Kam-F、 Kam-R、 GFP-F、 GFP-R、 RAP-F和RAP-R的核苷酸序列如下所示。

35、： 0059 Kam-F： tcagaagaactcgtcaagaaggcg(SEQ ID NO:8) 0060 Kam-R： ggctgctattgggcgaagt(SEQ ID NO:9) 0061 GFP-F： ggcaagctgaccctgaagttcat(SEQ ID NO:10) 0062 GFP-R： ttgtggcggatcttgaagttcacc(SEQ ID NO:11) 0063 RAP-F：如SEQ ID NO:6所示 0064 RAP-R：如SEQ ID NO:7所示 0065 3、实验数据测定 0066 1)形态观察 0067 分别对野生型白果森林草莓YW5A。

36、F7、野生型红果森林草莓Ruegen、突变体rap和在突变体rap中过表达RAP基因得到的植株RAP-ox； rap的表型进行观察，结果如图1所示，其中 YW5AF7具有红叶叶柄，白色花瓣和淡黄色心皮， rap的叶柄为绿色，而在突变体rap中过表达 RAP基因得到的植株RAP-ox； rap可以恢复野生型红色叶柄的表型，同时， RAP-ox； rap出现叶片有一些红褐色斑点和每个心皮的柱头变红的新表型，更进一步观察表明， RAP-ox； rap的叶柄表皮以及维管束及其周围花青素分布显著增加，表明RAP基因过表达可以恢复突变体 rap中器官的着色，并导致心皮柱头变红。。

37、0068 由于在野生型白果森林草莓YW5AF7中，其FvMYB10发生突变导致花青素无法合成，因此YW5AF7以及rap中果肉的颜色均为白色，在突变体rap中过表达RAP后，预期果实颜色无法变红。但是对野生型白果森林草莓YW5AF7、野生型红果森林草莓Ruegen、突变体rap和在突变体rap中过表达RAP基因得到的植株RAP-ox； rap的果实颜色进行观察，结果如图2所示， RAP-ox； rap的果实成熟后，花托表皮和果肉均变红，且色泽与Ruegen的红色不同。另外， Ruegen果实成熟后花托表皮和瘦果虽为红色，果肉却呈白色，这与RAP-ox； rap的果。

38、实颜色具有明显差异。 0069 2)花青素含量测定 0070 分别取野生型白果森林草莓YW5AF7、野生型红果森林草莓Ruegen、突变体rap和在突变体rap中过表达RAP基因得到的植株RAP-ox； rap的新鲜草莓果实以及叶柄为样品，测定样品中花青素的含量。 0071 花青素含量的具体测定方法为：用液氮将0.5g样品研磨至粉末状，加入5mL提取液 (甲醇：水：甲酸：三氟醋酸70:27:2:1)， 4冰箱中避光浸提12h，上清液用滤纸粗滤后备用，用紫外分光光度计(HoeferVision， SP-2001)检测滤液在530nm和657nm处的吸光值，花青素含。

39、量(A5300.25*A657)/M，其中A530和A657分别指530nm和657nm的吸光值， M指果实或叶柄鲜重(Zhang et al 2009)。每个样品有三个生物学重复，显著性差异采用IBM SPSS Statistis 22软件分析， P0.05。 0072 其中叶柄中花青素的含量如图3(a)所示，其中RAP-ox； rap与rap相比，叶柄中的总说明书 6/9 页 8 CN 110819603 A 8 花青素含量显著增加，与形态观察结果一致。 0073 果实中花青素的含量如图3(b)所示，其中RAP-ox； rap果实的花青素含量显著高于 YW5AF7或rap。

40、，但低于Ruegen，表明RAP基因过表达的植株RAP-ox； rap果实中花青素的积累并不依赖于MYB10。 0074 3)花青素组分分析 0075 分别取Ruegen和在突变体rap中过表达RAP基因得到的植株RAP-ox； rap的新鲜草莓果实以及叶柄为样品，测定样品中花青素组分。 0076 具体的测定方法为：用液氮将0.5g样品研磨至粉末状，加入2.5mL盐酸甲醇溶液 (甲醇：水：盐酸80:20:0 .1)， 4冰箱中避光浸提12h，取上清液于新的离心管中， 10000rpm 4离心20min，采用0.45 m的微孔滤膜过滤，放在棕色进样瓶中备用，采用 Dev。

41、elosil-ODS C18柱(5 m， 4.6mm*250mm)， Daojing LC-20AT高效液相色谱仪进行检测，色谱条件：流动相A： 1甲酸水；流动相B：甲醇。进样量为20 l，流速为0.6ml/min。流动相B的线性梯度： 010min， 1025； 1015min， 2530； 1550min， 3050； 50 60min， 5060； 6068min， 6010； 6870min， 10。扫描波长： 510nm。标准品为矢车菊素(Aladdin,27661-36-5)。 0077 其中叶柄中的花青素组分如图4(a)所示，叶柄中RAP-ox； rap。

42、与Ruegen的花青素组成成分相同，均含有芍药素-3,5-二葡萄糖苷(峰2)、矢车菊素-3-葡萄糖苷(峰3)和芍药素- 3-葡萄糖苷(峰5)，但这三种物质在RAP-ox； rap叶柄中的含量有所增加。 0078 在果实中， Ruegen含有丰富的矢车菊素-3-葡萄糖苷(峰3)和天竺葵素-3-葡萄糖苷(峰4)，而芍药素-3-葡萄糖苷(峰5)含量较低，与此相反， RAP-ox； rap的果实具有较高的矢车菊素-3-葡萄糖苷(峰3)和芍药素-3-葡萄糖苷(峰5)，而天竺葵素-3-葡萄糖苷(峰4)含量很低。这些结果表明RAP过表达改变了果实中花青素的组成。 0079 4)花青素积。

43、累时间测定 0080 分别观察RAP-ox； rap和Ruegen不同时期的花和果实的形态，根据Hollender, C .A .,Geretz ,A .C .,Slovin ,J .P .and Liu ,Z .(2012)Flower and early fruit development in a diploid strawberry,Fragaria vesca.Planta 235,1123-1139这篇文章将草莓花发育从分生组织到花期分为13个连续的阶段，分别为S1-S13，根据Fait,A., Hanhineva,K.,Beleggia,R.,Dai,N.,Rogache。

44、v,I.,Nikiforova,V.J.,Fernie,A.R.and Aharoni,A.(2008)Reconfiguration of the achene and receptacle metabolic networks during strawberry fruit development.Plant physiology 148,730-750将草莓后期果实发育分为绿熟期、白熟期，转色期、粉熟期和红熟期5个阶段。 0081 结果如图5所示， Ruegen花的心皮和花托呈现黄色，在转色期时瘦果和花托皮才开始变红，而RAP-ox； rap的心皮柱头在第9时期之前就变红了。

45、，授粉6天后果实花托积累大量的花青素，由于观察RAP-ox； rap在果实发育后期花托颜色不会加深，我们预测在果实发育后期，花青素不再产生。 0082 为了验证上述假设，将RAP过表达载体pK7WG2D-RAP通过农杆菌瞬时转化到YW5AF7 白熟期的果实中，具体操作步骤如下： 0083 蘸取-80保存的pK7WG2D-RAP农杆菌液于含有抗性的固体LB培养基(酵母膏 5g/L+蛋白胨10g/L+NaCl 10g/L+琼脂15g/L+庆大霉素50 g/ml+利福平50 g/ml+壮观霉素说明书 7/9 页 9 CN 110819603 A 9 50 g/ml)上，划线活化农。

46、杆菌， 28培养2-3d，挑取单克隆到6ml含有抗性的液体LB(酵母膏 5g/L+蛋白胨10g/L+NaCl 10g/L+庆大霉素50 g/ml+利福平50 g/ml+壮观霉素50 g/ml)， 28 震荡培养过夜，直到菌液OD达到0.8-1.0； 0084 取2ml菌液到离心管中， 5000rpm离心5min； 0085 用含有2蔗糖的液体MS(MS4.44 g/L+蔗糖20g/L,pH 5.8)重悬菌液，使菌液OD 值达到0.8； 0086 选择白熟期果实，用1ml注射器吸取菌液，注射到果实中， 1ml菌液可注射5-8个果实，做好标记，注射后一周左右观察结果。 0087 每。

47、个基因注射10个以上的果实。 0088 观察果实颜色的变化，结果如图6所示，直至成熟果实仍不会变红，表明花青素在发育后期没有产生。 0089 4)分子水平花青素积累 0090 为研究RAP-ox； rap果实花青素积累的分子机制，分别取Ruegen和RAP-ox； rap开花期的花托和转色期果实进行RNA-seq并进行差异表达分析，具体实验方法为：使用RNA提取试剂盒(生工)分别提取RAP-ox； rap和Ruegen开花期和转色期果实(包括花托和心皮)的 RNA，每个样品有三个生物学重复，每个生物学重复都含有3-6个果实，采用PE150方法构建 RNA序列库并采用Il。

48、lumina HiSeq X Ten进行序列测定。在2-PASS模式下使用STAR程序将每个样品中的数据(大约8G)比对到F.vesca基因组并使用V2.0.a2注释。 FeatureCounts用于计算每个基因的读取次数。差异表达基因通过R package DE Seq2分析。 0091 结果如图7(a)所示，转色期与开花期相比， Ruegen中有4831个基因上调， 6534个基因下调； RAP-ox； rap中有4470个基因上调， 6177个基因下调，共同上调的基因有3787个基因，下调的基因有5442个基因，这表明两种材料在果实发育过程中的转录情况相似。 0092。

49、由于在开花期RAP-ox； rap与Ruegen花托的颜色不同，我们比较了RAP-ox； rap和 Ruegen在开花期花托的基因表达水平，结果如图7(b)所示，与Ruegen相比， RAP-ox； rap中只有453个基因显著上调， 363个基因下调。 0093 由于果实的颜色发生变化，我们分析了花青素生物合成途径中的结构基因的表达水平，发现在Ruegen中，与开花期相比RAP在转色期时大量表达。此外，由于35S组成型启动子载体表达RAP，导致在RAP-ox； rap中的RAP表达水平更高，与发育阶段无关。 0094 随后，对开花期与花青素合成相关的15个结构基。

50、因(PAL1、 PAL2、 C4H、 4CL1、 4CL2、 CHS1、 CHI、 F3H、 F3H、 DFR2、 ANS、 UFGT、 FLS、 LAR、 ANR)的表达水平进行分析发现与Ruegen相比这些基因在RAP-ox； rap果实中的表达水平均未超过2倍，表明花青素生物合成途径处于非活跃状态。 0095 此外，由于缺乏功能性FveMYB10，与Ruegen相比RAP-ox； rap在转色期时果实中有7 个基因显著下调，结果如图7(c)所示，且花青素调控基因FveMYB10和FvebHLH3的表达水平没有显著变化。 0096 相关基因的表达水平如下表所示：说明书 8。