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CRISPR技术在作物育种中的应用

花匠小妙招
2024-12-15 04:01

原标题：《CRISPR/Cas 基因编辑技术及其在作物育种中的应用》
单位：中国农业科学院生物技术研究所

摘要：CRISPR/Cas 基因编辑技术在植物基因功能研究和作物遗传改良方面具有重要应用价值，其主要依赖gRNA引导核酸内切酶在目标基因组位置产生双链断裂（DSBs），DSBs 在通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）方式进行修复时，会引起靶标位置核苷酸序列的缺失、插入或者替换，从而实现基因编辑。介绍了 CRISPR/Cas 基因编辑技术的作用机理及发展趋势，并对 CRISPR/Cas 技术在主要粮食及经济作物育种中的应用进展进行了总结，以期为农作物育种提供有益的参考。

培育高产优质且抗逆性强的农作物品种一直是育种家追求的育种目标，而传统育种方法具有育种周期长、选育针对性差等缺点，难以实现快速育种的目标。CRISPR/Cas 核酸酶技术是近年来发展起来的对基因组进行精准定点编辑的技术，具有操作简单、周期短、效率高等优点，利用该技术可以对基因组中的目的基因进行定向敲除、插入或定点突变，从而精确引入目标性状，为作物育种工作提供新的途径。

1、CRISPR/Cas 基因编辑技术简介及发展

CRISPR/Cas 基因编辑技术（genome editing）是植物基因功能研究和育种改良的热点技术，其由小分子 RNA 介导，且主要依赖于核酸内切酶在目标位置产生双链断裂（double strand breaks, DSBs），DSBs 可以通过非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HDR）两种方式进行修复，通过 NHEJ 的修复容易发生错误，使断裂位置产生小片段的缺失或插入，从而导致基因突变；在有供体 DNA 存在的情况下，有可能通过 HDR 进行断裂位置的修复，产生精准的基因插入或替换。

CRISPR-Cas 系统包括Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三种类型，其中Ⅰ型和Ⅲ型需要多种蛋白参与才能形成具有功能的 Cas 蛋白复合体，而来自于化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Ⅱ型系统仅需要一种 Cas 蛋白就能够发挥作用。在Ⅱ型 CRISPR-Cas 系统中，入侵的外源核酸序列整合到前导序列与第一段重复序列之间，并转录成长链的 CRISPR RNAs（crRNA）前体物，与反式激活 tracrRNA（trans-activating crRNA）互补结合，然后在 Cas9/RNAseⅢ加工下形成成熟的 tracrRNA: crRNA 复合物，通过 crRNA 与入侵 DNA 上原间隔序列互补配对，从而激活并诱导 Cas9 蛋白到原间隔序列的区域进行剪切，该过程需要在靶标 DNA 上有一段保守的 PAM（protospacer adjacent motif）序列。Cas9 蛋白包括两个区域，其中 HNH 结构域切割与 crRNA 互补的 DNA 链，RuvC-like 域则剪切非互补的 DNA 链，从而形成 DSBs，降解入侵片段。科学家利用上述原理，通过将 crRNA 和 tracrRNA 序列相连构成一个嵌合的 sgRNA（small guide RNA）分子，实现对靶标的识别，并利用 Cas 蛋白进行定点剪切形成 DSBs，随后通过体内 NHEJ 或 HDR 方式进行修复。近来，新一代 CRISPR 基因编辑工具 CRISPR/Cpf1、单碱基突变及无外源 DNA 污染编辑的出现，标志着 CRISPR 基因编辑技术又取得了突破性进展。

1.1 新一代 CRISPR 基因编辑工具 CRISPR/Cpf1

2015 年，张锋团队首先发现了Ⅱ类 CRISPR 系统第 5 亚家族的成员 Cpf1 核酸内切酶，并证实了来自氨基酸球菌属（Acidaminococcus）、弗朗西斯氏菌属（Franisella novicida）和毛螺科菌属（Lachnospiraceae）的 AsCpf1、LbCpf1 和 FnCpf1 都具有 RNA 引导的 DNA 内切酶活性，且 AsCpf1 和 LbCpf1 用于动物的基因组编辑效率与 CRISPR/Cas9 系统相似，但其与 Cas9 相比却具有更多优势：①Cpf1 蛋白因更小而更容易进入组织和细胞；②Cpf1 同时具有 DNA 和 RNA 内切酶活性；③Cpf1 的初级转录产物 pre-crRNA 由 Cpf1 自身加工，不需要 tracrRNA 的参与；④Cpf1 识别位于靶序列 5′端富含胸腺嘧啶（T）的 PAM 序列，扩大了基因组编辑的靶点范围；⑤Cpf1 的切割位点离 PAM 序列较远，便于对同一位点进行多轮基因编辑；⑥Cpf1 剪切后形成黏性末端，让 DNA 插入更可控。目前 CRISPR/Cpf1 基因编辑系统已被用于水稻、拟南芥等物种的基因组编辑，朱健康团队[4] 利用该技术对水稻中 RLK 和 CYP81A 家族的 4 个基因进行同时编辑，各位点的敲除效率达到 40%~75%。近期，中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴团队与华中农业大学赵云德团队合作，利用能够识别「TYCV」序列的 LbCpf1(RR) 和 LbCpf1(RVR) 变体，以水稻 OsPDS 和 OsSBEIIb 基因为靶标基因，LbCpf1(RR) 编辑效率达 51% 左右，该研究扩展了 CRISPR/Cpf1 系统在植物基因组中的编辑范围。

1.2 单碱基突变编辑

在农作物遗传改良方面，少部分可以通过完全破坏基因功能来获得育种材料，但更多的是需要置换单个或数个碱基来改变基因的功能，从而实现定向改良作物农艺性状的目的，而利用 CRISPR/Cas9 定点修饰主要是依赖于效率低下的同源重组机制。2016 年，哈佛大学 David Liu 团队发现了一种新的基因编辑工具——单碱基编辑系统。单碱基编辑技术通过将 Cas9 切口酶 (Cas9 nikase, Cas9n) 或无核酸酶活性的 Cas9（nuclease dead Cas9, dCas9）与胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1）形成融合蛋白，并通过 sgRNA（单链向导 RNA）将融合蛋白引导至靶位点，在不引起 DNA 双链断裂的情况下对靶位点附近的单个碱基进行由 C/G 到 T/A 的精确置换，目前该技术已在植物、动物以及人细胞中实现了高效的定点突变。朱健康团队利用单碱基编辑系统 APOBEC1-XTEN-Cas9（D10A），率先实现了对水稻氮转运蛋白家族 NRT1.1B 和 DELLA 家族 SLR1 的碱基替换，随后高彩霞团队通过改进，成功地将此系统运用到三大重要农作物小麦、水稻和玉米的性状改良上，为作物品种改良带来了新的途径。

1.3 无外源 DNA 污染编辑

目前常用的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术主要是通过基因枪或农杆菌侵染的方法将 DNA 表达框整合到植物基因组中，此种方法一般需通过后代分离才能获得无 CRISPR/Cas9 DNA 的突变体材料。DNA|free 基因组编辑技术的建立，大大降低了外源 DNA 的整合率，为 CRISPR/Cas9 技术用于农作物品种改良提供了新思路。DNA|free 基因组编辑是通过将 CRISPR/Cas9 蛋白与 gRNA 在体外组装成核糖蛋白体（RNP），实现无外源 DNA 的基因编辑体系，避免外源 DNA 整合到基因组中产生潜在风险，从而推动作物基因编辑育种的发展。此技术已经在拟南芥、烟草、生菜等模式植物和水稻、玉米、小麦等主要粮食作物中得到了成功应用。高彩霞团队以小麦为研究对象，对此方法步骤做了详细总结，为其广泛应用提供了有力的技术支持。最近，瑞典科学家利用 RNP 方法成功实现了马铃薯的 DNA-free 基因组编辑，编辑效率达 9%~25%。

2、CRISPR-Cas 技术在作物育种中的应用

自 CRISPR/Cas9 技术被用于进行基因定点编辑以来，被广泛应用于酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠、人类等多个物种中。2013 年 8 月，《Nature Biotechnology》期刊上同时刊登了 3 篇关于 CRSPR-Cas9 技术介导植物基因组定点编辑的文章，预示着该技术在植物中的广泛应用和迅速发展。其中 Nekrasov 等利用 CRISPR-Cas 技术在本生烟（Nicotiana benthamiana）中实现了基因组的定点突变，突变效率约为 2%；Li 等利用 CRSPR-Cas9 分别对拟南芥和本生烟中的 PDS 基因进行定点编辑，在原生质体系统中，拟南芥 AtPDS 和本生烟 NbPDS 突变效率分别为 5.6% 和 38%，而通过农杆菌浸染发现，在植物中 AtPDS 和 NbPDS 的突变效率相差不大（拟南芥为 2.7%，本生烟为 4.8%），表明突变效率与植物基因型、生理状态和转化方式密切相关。该研究还在原生质体中成功实现了对 AtPDS3 的两个不同位点和同时对两个基因（AtRACK1b 和 AtRACK1c）的编辑，为植物基因编辑打开了新的思路；高彩霞团队利用基因枪技术首次在水稻中对 OsPDS 和 OsBADH2 基因进行敲除，突变效率分别为 9.4% 和 7.1%，并获得了 T0 代 PDS 基因敲除的水稻纯合突变植株。同时，朱健康团队也利用 CRISPR-Cas9 技术分别在拟南芥和水稻中进行基因定点突变，突变效率分别为 26% 和 84%；瞿礼嘉团队通过对 Cas9 蛋白进行优化，使该系统在水稻中对 OsCAO1 和 OsLAZY1 基因的编辑效率分别高达 83% 和 92%。CRISPR/Cas9 技术在植物中，尤其是作物中的成功应用，为该技术在作物品种改良中的应用提供了有力的技术支持，随后大量相关研究相继开展。

2.1 在粮食作物育种中的应用

水稻是世界上最为重要的粮食作物之一，并且水稻遗传转化更易操作，因此近年来利用 CRISPR/Cas9 技术开展与水稻产量、品质及抗性相关的研究被大量报道。产量方面，王加峰等利用 CRISPR/Cas9 技术对调控水稻产量千粒重的基因 TGW6 定点编辑，T0 代材料中该基因突变频率约为 90%，其中纯合缺失突变率高达 51%，T1 代纯合缺失突变体千粒重显著增加。Li 等利用 CRISPR/Cas9 技术以中花 11 作为转化材料对 Gn1a、DEP1、GS3 及 IPA1 基因进行定点敲除，结果表明 T0 代材料中突变效率分别为 42.5%、67.5%、57.5%、27.5%，T2 代纯合缺失突变体中植株籽粒数目及长度增加，达到增产的效果；品质方面，中国水稻研究所和东北地理与农业生态研究所同时采用 CRISPR/Cas9 技术对控制水稻香味的 BADH2 基因进行敲除，结果表明突变体材料中香味物质显著增加，为香稻育种提供了丰富的理论指导，加快了香稻的育种进程。抗性方面，李家洋与高彩霞团队利用 CRISPR/Cas9 技术以 NHEJ 修复方式对水稻 5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因（EPSPS）进行编辑，实现了水稻内源 EPSPS 基因保守区域两个重要氨基酸的定点置换，在 T0 代获得具有草甘膦抗性的突变体材料。Wang 等利用 CRISPR/Cas9 技术修饰稻瘟病侵染效应因子基因 OSERF922，以提高水稻对稻瘟病的抗性。近期，Tang 等与袁隆平团队利用 CRISPR/Cas9 技术敲除水稻中与镉离子吸收和积累相关的基因，获得了抗镉毒害的水稻品种。此外，朱健康研究组利用新型腺嘌呤碱基编辑器 ABE7-10 对调节水稻株型的 OsSPL14 和 SLR1 进行单碱基编辑，A/T 到 G/C 的替换效率分别为 26% 和 12.5%，该研究推动了作物精准分子育种的发展。

玉米不仅是世界第一大粮食作物之一，也是饲料、化工和医用等的原料。朱金洁等经过摸索，搭建了玉米基因组高效定点突变的技术平台，并在玉米全基因组范围内筛选高度特异的 sgRNA 靶标序列，为玉米品种改良提供了强有力的技术支持。杜邦先锋公司利用 CRISPR-Cas9 技术，将自然存在的糯玉米性状直接引入具有优良性状的杂交种中，解决了糯玉米产量低的问题，同时避免了繁杂的回交育种工作，同年，该公司利用 CRISPR-Cas9 技术将一个玉米内源启动子 GOS2 精确插入到玉米中乙烯应答调控因子 ARGOS8 的 5′端，获得耐旱材料。

小麦属于异源多倍体，基因组庞大，因此通过传统方法育种难度很大。Zhang 等利用 CRISPR/Cas9 系统对小麦粒长和粒重调控基因 TaGASR7 和穗密度调控基因 TaDEP1 进行定点编辑，获得的 TaGASR7 纯合突变材料粒重显著增加，TaDEP1 纯合突变材料明显变矮。高彩霞和唐定中团队利用 CRISPR/Cas9 技术，获得了同时敲除 3 个同源基因的突变体，该突变体对上灰（baifen 病）表现出有较强抗性。

2.2 在经济作物育种中的应用

Cai 等利用 CRISPR/Cas9 技术对大豆光周期开花途径关键基因 GmFT2a 进行了定向编辑，靶向大豆内源 GmFT2a 上的 3 个位点，T1 代纯合突变体植株花期延迟。Wang 等建立了适用于棉花遗传转化体系的 CRISPR-Cas9 系统，以棉花叶绿素合成相关基因 GhCLA1 为靶标设计 3 对 sgRNA，各靶标位点的编辑效率高达到 66.7%~100%，为推动棉花基因组编辑工作打下了坚实基础。Xu 等利用 CRISPR-Cas9 技术对 CLV3 进行了基因编辑，使得番茄果实的心室数显著增加；Soyk 等采用 CRISPR/Cas9 技术对番茄抗成花基因 SP5 G 进行定向编辑，突变体材料番茄开花及成熟时间提前约 2 周，且产量显著增加。以上研究结果表明该技术在番茄重要农艺性状改良方面具有巨大的应用潜力。双孢菇 (Agaricusbisporus) 非常容易褐变，从而影响其品质。Waltz 利用 CRISPR/Cas9 技术对双孢菇的 1 个多酚氧化酶基因 PPO 进行定向编辑，获得的突变体材料中多酚氧化酶的活性降低了 30%，抗褐变能力大幅提高。

3、展望

传统育种需要投入大量的时间和精力，才能将相关基因的有益变异累积为最佳的品种，而通过 CRISPR/Cas9 技术能够直接且有目的进行优良性状选择。但 CRISPR/Cas9 系统目前还存在一些技术方面的问题，有待进一步改进和探讨：①以往报道的 CRISPR/Cas9 技术在应用过程中会出现一定程度的脱靶现象，引起基因组非靶向位点的突变，这样会造成研究结果的不确定性，严重限制了该技术的应用。提高 sgRNA 序列特异性和使用合适的 Cas 蛋白等都能够有效降低甚至消除脱靶现象。此外，2017 年 Rauch 等在细菌中发现了能够阻断 CRISPR-Cas9 活性的 AcrllA4 蛋白，该蛋白让 CRISPR-Cas9 在基因编辑一段时间后「关闭其活性」，防止在不必要的位点随意剪切造成的脱靶效应。在此基础上，Yang 和 Patel 采用冷冻电子显微镜和人体细胞培养等方法进一步揭示了 AcrIIA4 主要是通过竞争 Cas9 蛋白上的 DNA 结合域发挥作用，这一发现为 CRISPR/Cas9 技术在育种中的广泛应用提供了强有力的支持和保障。②基因编辑范围有限。CRISPR 系统中，DNA 的精确剪切依赖于 gRNA 及 PAM 序列。目前的研究中，CRISPR/Cas9 所识别的 PAM 位点包括经典的「NGG」和 Cas9 改变后的「NGA」和「NGCG」等。CRISPR/Cpf1 系统的发现进一步拓宽了基因组编辑的范围，与 CRISPR/Cas9 不同，CRISPR/Cpf1 的 PAM 序列主要位于「T/A」富集区，包括 LbCpf1 识别的「TTTV」及 LbCpf1(RR) 变体识别的「TYCV」。如何有效拓展 CRISPR 系统 PAM 位点范围，是该技术在育种中广泛应用的关键所在。③提高同源重组（HDR）效率。目前 CRISPR 技术在作物育种中的应用，主要集中于依赖 HNEJ 途径的基因敲除，如何通过 HDR 实现高效率的大片段插入或碱基替换仍是一个挑战。Charpentier 等最近的研究中，通过将同源重组过程早期关键蛋白 CtIP 与 Cas9 蛋白融合，从而激活 HDR 途径，在人类细胞、鼠受精卵细胞中将编辑效率提高 2 倍以上。Aird 等将供体 DNA 通过 PCV 共价键连接到 Cas9/gRNA 核糖核蛋白复合体上，增加 DSB 处供体 DNA 的浓度，从而提高 Cas9 介导的同源重组修复效率。利用 HDR 在靶位点插入目的基因，将是基因编辑育种的重要攻关内容之一。

总之，虽然目前基因编辑技术还存在很多不足，但其相对传统育种的优势显而易见，因此其具有广阔的发展和应用前景，相信在不久的将来，经过优化和改良的基因编辑技术将成为培育作物新品种的主要手段之一。