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龟甲龙的组织培养与快速繁殖（2005年）

花匠小妙招
2024-12-16 14:25

岩鸣为本文第二作者

1. 植物名称龟甲龙（Dioscorea elephantipes），南非种。

2. 材料类别冬季块根长出的细茎，取距茎尖5 cm的茎段。供试植株来源于日本カクタヌ专门家联盟。

3. 培养条件（1）启动培养基：M S + 6-BA 1.0 mg•L-1(单位下同)+ NAA 0.2 ；（2）分化培养基：M S + 6-BA 1.0+KT 1.0 ；（3）增殖培养基： M S + KT 0.5 + NAA 0.1 ；（4）复壮与生根培养基：1/2M S + NAA 0.1+氯化胆碱10 。以上培养基均加入3%蔗糖,0.7%琼脂，pH 6.0。培养的温度为（25±2）℃，光照8 h•d-1,光照度为2000 lx。

4. 生长与分化情况

4.1 无菌材料的获得将截取的材料剪去叶片，经流水冲洗5 min，1%新洁尔灭浸洗5 min，无菌水冲洗3次，2%NaOCl溶液8 min，无菌水再冲洗4～5次。将消毒的材料置于无菌滤纸上，剪切成带有叶腋的小段，即成外植体。

4.2 启动培养将龟甲龙的外植体接入启动培养基（1），10 d后从叶腋、伤口等处陆续产生绿色愈伤组织。20 d后叶腋处愈伤生长迅速，并且最先形成绿色球状小体 (GCB)；伤口处愈伤组织仍然单纯增殖，未见有分化特征。

4.3 分化培养将叶腋处形成的愈伤组织整个转入分化培养基（2）中，30 d后GCB开始向芽分化，从表面可以很直观地看到很多芽点，呈浅绿色。继续培养15d可以形成丛生芽，可见部分芽开始伸长并有小叶萌出。

4.4 芽的增殖将上述培养物作适当分割后转入增殖培养基(3)。大约20 d后各瓶都可以形成整瓶丛生芽，此时由于激素浓度改变，叶片退化，茎大量增殖，增殖速度非常快，远远超过带叶子的芽增殖。每20 d作为一个继代周期，将伸长的茎段适当分割，即可转入新鲜培养基中继续增殖。在增殖3~4代的时候会出现不同程度的玻璃化现象，此时可转入空白MS中继代1~2次即可纠正玻璃化，这可能是由于细胞分裂素（CTK）积累过多的缘故[1]。然后仍然转入在培养基（3）中增殖。芽增殖倍数3~4倍，不宜超过6倍，否则会延长继代周期。此外，分割的茎段都必须带有2个以上叶腋，否则茎段会发生退化性坏死。

4.5 壮苗与生根在增殖培养基（3）上得到的苗基本上无叶，将这样的茎段分割为带有3个叶腋的小段，转入培养基（4）中。15 d后新叶出现，并逐渐增多增大，30 d左右茎段基部开始膨大，并于膨大部位的下部有绒毛状根形成，不见伸长，生根率约80%。茎的膨大可能与氯化胆碱作用有关[2]。茎膨大率在80%以上，此时须加强光照至3000 lx，最佳效果是配合日光照射，继续培养10 d，每个小苗都有6片以上叶子的时候可以进行移栽，此时下部块茎直径平均0.3 cm左右，不超过0.5 cm。

4.6移栽采用蛭石：珍珠岩：泥炭=2：1：1的混合基质，经高压灭菌后装入苗钵，距顶端大约5 cm。将开口炼苗1 d的出瓶苗均匀插入基质中，使小块茎刚好埋入土内，用家用保鲜膜保湿。用青霉素（80万µ/L）、链霉素（0.5g/L）、甲硝唑（0.1g/L）、制霉菌素（100µ/L）配成的“四抗”溶液浇灌，逐渐见光。采用“四抗”和日光辅助照射可提高小苗成活率到80%以上。如果采用多菌灵等农药进行处理或者单纯使用日光灯照射的小苗成活率低于40%，小苗大多感染放线菌和真菌以致死亡。日光辅助照射的小苗叶片肥厚，颜色浓绿，抗病性与抗倒伏性明显优于单纯日光灯照射组。

5. 意义与进展

龟甲龙是薯蓣科薯蓣属的多肉植物，也是薯蓣科为数很少的多肉植物之一。原产于非洲南部干旱地区，在墨西哥中部平原还有一种类似种，称为墨西哥龟甲龙。本文中用的植物材料是非常著名的茎干多肉的多肉植物之一，作为一个代表种被植物园和科研单位收集研究。其块茎表皮干厚皴裂，形成类似树皮状“龟甲”，在休眠期成为典型的拟态植物；生长期伸出藤蔓状细茎，并长出心形的叶，故具有很高的观赏性和收集价值。此外其块茎内富含淀粉物质，可作为淀粉性食物。龟甲龙主要是播种繁殖，由于是雌雄异体，需很多年才可以开花，故而严重限制了该物种的繁殖。组织培养法可能是解决此问题的手段。另外，我们采用了氯化胆碱诱导块茎形成，这与文献[2]中氯化胆碱诱导甘薯点淀粉储存和沉积的结果类似。还有，我们采用“四抗”法移栽的杀菌效果明显，优于多菌灵等常规杀菌剂。龟甲龙的组织培养和快速繁殖未见报道。

参考文献：

[1]卜学贤，陈维伦. 试管植物的玻璃化现象. 植物生理学通讯，1987，5：13-18

[2] 何若天. 氯化胆碱在植物生长与光合作用中的生理学效应. 广西农业大学学报，1995，14（2）：176-179