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植物有害生物监测：从卫星到分子

花匠小妙招
2024-09-14 08:38

Silva G, Tomlinson J, Onkokesung N, et al. Plant pest surveillance: from satellites to molecules[J]. Emerging topics in life sciences, 2021, 5(2): 275-287.

https://doi.org/10.1042/ETLS20200300

遥感

植物疾病改变了太阳辐射与叶、冠层和植物能量平衡的相互作用的方式，这可以通过近端（非空中）和远程（空中）传感检测。遥感是利用非地面成像系统获取有关地球上过程和事件的信息，独特的是在本处讨论的检测和诊断方法中，它能够对疾病进行大规模被动监测，而不是主动采样。大多数田地太大，种植者无法经常进行经济高效的监测；遥感使高时空分辨率监测能够用于在流行病出现之前向患病植物部署高精度的地面诊断和修复活动。

宽波段和多光谱方法主要依靠可见光（VIS）和近红外（NIR）反射指数，如归一化植被指数（NDVI，近红外通道与可见光通道反射差之差与之和的商，反映土地覆盖植被状况的一种遥感指标），自20世纪80年代以来一直被用来感知晚期植物疾病[23-25]。但与其他类型的农业传感（如用水量和监测营养缺乏）相比，植物病害遥感仍然不发达。这是因为历史上可访问的数据库缺乏空间、时间和/或光谱分辨率，无法促进早期疾病干预。尽管有这种长期确立的概念证明，例如，Landsat-8 和 Sentinel-2 图像可以间接识别暗示疾病的变异，但由于其粗糙的光谱和空间分辨率，对大多数种植者来说是不可诊断和不可操作的。遥感技术、方法学和分析的最新进展有助于解决其中一些历史挑战。商业卫星，例如Planet Labs和Maxar现在能够频繁、精确地返送高空间和时间分辨率的信息，且光谱分辨率不断提高，最近已确定能够进行疾病监测[26，27]。无人驾驶飞行器（UAV，或"drones"）和低空飞机已具备能够进行疾病检测和监测的充分能力，但可靠的区分和诊断仍然具有挑战性[28-32]。由于每周向次周提供图像卫星、空中和/或无人机图像的服务提供商越来越多，种植者现在可以广泛获得这类图像。一些提供商包括气候公司、藤观、塔拉尼斯和谷神星成像，许多小型提供商为市场提供无人机图像。

较广泛的多波和窄带可见光到短波红外（SWIR ; 400-2500 nm）近端和遥感的出现，以其新建立的症状前疾病检测[32-37]和区分[38，39]的能力，重振了植物疾病传感学科。

通过手机图像分析的疾病检测

现代智能手机中成像、电信和计算技术的结合为它们作为诊断工具提供了多种机会，几乎可以立即捕获、显示和共享结果。大多数类型的作物病虫害都会引起受过培训的人员可以识别的明显症状，但农民很少能接触到这些症状，特别是在发展中国家。为了克服这个问题，可以使用智能手机捕捉症状图像，然后通过互联网将其发送到人类专家可以进行诊断的平台[40-42]。另一种策略是基于人工智能和机器学习方法，可以在现场直接检测和识别害虫。

这些技术已经被利用来开发了几个免费的智能手机应用程序，用于广泛的作物/虫害组合。Leaf Doctor[43]是一个对植物疾病进行定量评估的系统；Pestoz（Creotix，印度）通过蔬菜和作物植物的图像诊断疾病，主要集中在印度；Plantix（PEAT GmbH，德国）是一个对作物的疾病、害虫损害和营养缺乏进行诊断的系统。PlantVillage Nuru[44,45]（图1）是一个用于诊断木薯病毒性疾病和FAW对玉米造成的损害的系统；Tumain(哥伦比亚国际热带农业中心-CIAT)[46]是一个用于识别影响香蕉植物的疾病。这些应用程序还提供了一个载体，以提供管理所确定的害虫的建议。PlantVillage Nuru和Tumaini可以在没有互联网连接的情况下使用，这在偏远的农村地区是一个非常宝贵的功能。

图1

用于训练模型的图像的质量和数量以及疾病症状的变化和复杂性等条件会影响诊断系统的准确性(敏感性和特异性)[47]。现场条件，如阳光、风和雨，也会影响诊断系统的准确性。Mrisho等人[47]和 Ramcharan等人[45] 表明使用一片叶子的 PlantVillage Nuru的现场准确度（21-59%）低于屏幕准确度(43-81%)。然而，当 PlantVillage Nuru检测的叶子数量增加到每株植物6片时，木薯花叶病的准确率提高到93%，木薯褐条病的准确率提高到73%，木薯绿螨病的准确率提高到93%[47]。

关于Leaf Doctor、Pestoz和Plantix的准确性（包括现场的和屏幕上的）的信息尚未公开，而Tumaini的屏幕准确性据说在70%到99%之间。

然而，关于数字诊断应用程序与其他诊断方法的比较的信息有限；植物病害的主要替代诊断方法是由农民或农业推广人员对植物进行目视检查。Mrisho等人使用标准的170张单木薯叶图像[47]表明PlantVillage Nuru能够以高于农业推广人员(50%)和木薯种植者(42%)的准确率(64%)诊断疾病症状，这表明诸如此类的诊断应用程序可以提供一种手段提高用户的诊断能力。然而与其他测试方法相比，大量数据可以在不显着增加监测成本的情况下被收集。因此这些应用程序已经被用于绘制病虫害发生和传播的地图，这有助于预测和评估有害生物风险（未公开数据）。

通过便携式VOC传感器的病原体检测

植物释放的挥发性有机化合物(VOC，提供有关植物的生长、防御和健康状况的信息) 已成为检测病原体和害虫的非侵入性诊断标志物[48–52]。基于实验室的技术，例如气相色谱-质谱法 (GC-MS) [53]，其周转时间很慢，因此应用有限。植物生物源VOC的直接现场测量可以更准确地评估自然条件下排放的VOC通量，近年来已经探索了几种方法。

微型气相色谱-质谱仪采用了与实验室仪器相同的检测机制：例子包括离子迁移谱仪(IMS)[54]、离子阱迁移谱仪(TMS)[55]和微分迁移谱仪(DMS)。一个微型GC-DMS设备被开发，用于快速区分健康的和被栎树疫霉猝死病菌感染的杜鹃花植物的VOCs [56]，并证明了一个全自动的轻型GC设备可以区分健康的和被蚜虫感染的乳草，准确率>90% [57] 。

电子鼻(e-nose)是一种人工嗅觉装置，它利用一系列交叉反应的气体传感器对给定的气体分子或混合物产生指纹响应，而无需识别单个化合物[58–60]。电子鼻作为用于快速检测植物VOC的现场系统很有吸引力，并已用于诊断无症状苹果树中的火疫病和花疫病[61–63]和番茄幼苗的早疫病/灰霉病[64]。电子鼻设备有几个限制，限制了它们作为诊断工具的采用，包括信号漂移、对湿度的敏感性、中等灵敏度、复杂的数据处理和高购买成本。

Li 等人已经证明了一种基于智能手机的气体传感器，用于植物病害的无创诊断[65](图2A)，将明场智能手机显微镜与纸基比色化学传感器阵列[66,67]相结合，以实现对绿叶挥发物和植物激素的高灵敏度。该设备能够在接种后2天能识别无症状植物中的晚疫病菌(P. infestans)，并准确区分晚疫病菌与其他病原体。将“可穿戴”传感器集成到植物的叶子或茎上(图2B)，为实时和无线监测植物健康[68,69]，包括持续监测植物挥发性有机化合物[70]带来了巨大希望。

图2

蛋白质诊断平台：侧向层析（LFA）

侧向层析 (LFA)是简单、快速且经济高效的免疫层析检测(以家庭妊娠检测为例，此时通常称为胶体金免疫层析)，无需设备或技术专长即可检测目标蛋白质[71]。

侧流装置 (LFD) 由塑料粘合剂背卡上的四个重叠膜（样品垫、结合垫、抗体膜/测试垫和吸附垫）组成（图3A）。检测特定蛋白质或分子标记的抗体印在膜上。LFA的准确性取决于抗体的特异性和功效。多重 LFA (xLFA) 可检测同一条带上的多个标记物(图3B)，从而实现更高效的测试，尽管在不影响特异性和灵敏度的情况下设计它们更困难[72]。

图3

LFAs在农业部门内很好地用于农作物病害检测，虽然与核酸诊断试验相比[74]，其对检测低密度标记物或病原体缺乏敏感性，但LFAs是目前检测速度最快最简单的试验之一，便于现场快速决策，无需设备。

除了疾病检测，LFA还可用于探索与控制相关的复杂性状。由于对除草剂的抗性而导致的杂草控制不利会导致巨大的成本；例如，抗除草剂的黑草与英国每年100万吨的小麦产量损失有关 [75]。因此，快速可靠地诊断除草剂抗性是改善杂草控制和最小化其对作物生产和农业经济的不利影响的重要步骤[76,77]。例如，蛋白质生物标记物的早期检测，在黑草谷胱甘肽-S-转移酶phi(F)1及其在黑麦草、不实雀麦和草甸雀麦中的直系同源物中使用LFA证实了这些物种中存在除草剂抗性 [78]。此类信息对于种植者和顾问采取适当的杂草控制措施非常宝贵。

由于疾病（重新）出现以及对杀菌剂、杀虫剂或除草剂的更可持续应用的需求，对农业中用于疾病和抗性检测的快速测试（例如xLFA）的需求不断增长。结合LFA和其他测试结果以提供结果解释和建议行动的数字农学系统将改进问题的早期诊断并帮助农民采用新技术。

核酸检测方法

以病原体核酸为目标的检测方法能够以非常高的特异性针对特定物种，并有可能非常敏感[19,79]。在实验室中，最常用的方法是使用聚合酶链反应 (PCR) 来扩增目标特异性序列。最常见的PCR在诊断环境中作为实时PCR或定量PCR (qPCR) 实施，以提高通量并限制PCR后污染。这些技术（包括快速循环变体[80]）已在植物害虫检测中使用了二十多年[81]。

基于PCR的方法已经集成到微流控“芯片实验室(lab-on-a-chip)”装置中，使扩增和检测变得更加微小。该方法已被用于开发便携式植物病原体检测装置[82，83]，但不含抑制剂的核酸提取过程要么增加了系统的复杂性，要么检测前需要进行芯片外处理。

不使用PCR的核酸扩增方法具有现场使用的潜在优势[84]。等温方法避免了热循环，允许使用不太复杂的仪器甚至体温来达到反应温度。这带来了在更广泛的环境中使用和集成到自动化系统中的潜力。环介导等温扩增 (LAMP)、重组酶聚合酶扩增 (RPA) 和解旋酶依赖性扩增 (HDA) 是等温扩增方法，它们具有较短的反应时间（通常为10–30 min）并且在简化样品制备时对共提取的抑制剂具有耐受性方法，使其非常适合现场使用。

基于核酸的方法有可能在实验室外使用，已被开发用于植物病原体，包括病毒、细菌、真菌和卵菌[87]。这些方法中的大多数已用于以相对较低的吞吐量测试具有疾病症状的植物组织的小样本，以确认特定害虫的存在。非常适合处理植物组织的小样本（例如单个或切除的病灶）的粗提取方法已经被开发。将现场核酸检测的使用扩展到要在观察症状之前检测疾病的应用将需要能够检测更大的样本，同时保持操作简单性和高灵敏度。

对于最终用户而言，全自动系统最为简单，例如在独立仪器中将空中孢子捕捉仪与基于DNA的定期自动化作物真菌病害检测相结合的平台。

DNA测序技术

对样品中所有核酸进行测序的能力使采用非靶向方法成为可能，询问“该样品中存在什么？” 与询问“此样品中是否存在病原体X？”的靶向检测相反。也可以问一个半针对性的问题，例如“这个样本中有哪些细菌？” 使用宏条形码技术（利用生物基因组中普遍存在的一段较短的、标准的DNA序列作为分子标记,通过参考数据库同源比对以及进化树分析来确定物种间的亲缘关系,从而实现动植物、真菌等物种的快速准确鉴定），其中只对特定的和分类群区分的基因进行测序。最近高通量测序 (HTS，能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术) 对植物健康诊断的影响得到了综述[17]。

Roche、Illumina和Pacific Biosciences等公司生产的HTS平台通常庞大、复杂，且资金和试剂成本昂贵，并且往往驻留在专门的测序实验室中。2014年，牛津纳米孔科技 (ONT) 开发了MinION，这是第一款便携式高通量测序仪，可生成高达30 Gb的数据。有关MinION的更多信息，请访问https://nanoporetech.com/。涉及 Flongle（流通池适配器）(图4)的最新发展使MinION能够使用低成本（<100 美元）的微型流通池，在其他HTS平台不实用或过于昂贵的情况下为诊断测试带来了潜力。MinION的低资本成本和微型流通池的低成本为该技术在资源匮乏的实验室中提供了潜在的应用，使他们能够参与基因组学革命，而无需更传统的基因组测序仪的大量资本支出。MinION已被证明可用于检测入侵植物的细菌、病毒、真菌、植原体和昆虫[88,89] 以及在非洲实地进行病毒监测，尽管错误率被认为会导致种系发生分析问题[90]。

图4

大多数HTS平台产生短DNA片段，但ONT和Pacific Biosciences平台对更大的DNA片段进行测序，从而可以分析混合群体中存在的基因型。Radhakrishnan[91]证明ONT可用于快速识别小麦黄锈病病原体Puccinia striiformis f.sp. tritici (Pst)的单个菌株。与其他HTS平台相比ONT技术特别适合低资源环境，这有助于增加对这种破坏性病原体菌株的监测，并能够更精确地选择合适的品种。虽然有研究人员在现场使用ONT平台的例子[90]，但需要更多的工作来简化协议和数据分析，使其成为常规现场测试，供农民或农艺师等非专业人士使用。

合成生物学用于自我报告的潜力

目前为止讨论的几乎所有方法都需要用户主动与技术交互。主动监测可能既费力又费时[92]，最终会限制采用。合成生物学提供了一种通过生物传感器开发从主动监测过渡到被动监测的潜在途径[93]，其中设备被设置为监测感兴趣的区域。合成生物学通过应用于生物系统的工程设计原理，为诊断设备的开发提供了一种快速且具有成本效益的工作流程，从而缩短了设计-构建-测试周期[94]。工程基因线路可以将复杂的技术交到非专业操作者手中，并产生简单、信息丰富的输出，从而实现快速、明智的决策[95](图5A)。

图5

这些电路可以按照“自上而下”（应用驱动）或“自下而上”（重建）方法进行设计[96]。与监测和现场诊断相关的是最近从传统的基于细胞的部署到无细胞系统的转变(图5B)。这具有不需要在实验室以外使用转基因生物的独特优势[97]。使用易于使用的低成本现场诊断已经成为可能。最近一种可现场部署的生物传感器被部署，该传感器利用核糖开关检测水样中的氟化物，在检测到氟化物样品时会产生可见的颜色变化[98]。下一个挑战是从诊断转向监测。使用此类设备并将其嵌入材料（如纸或水凝胶）中的潜力[99]，使此类诊断成为具有现场实际存在的监测系统，而不是复杂的专家诊断(图5C)。目标是开发可嵌入农业环境的生物传感器，用于监测作物病原体或其载体，并且足够强大以处理土壤或地下水等复杂样品，这些样品可以抑制其他诊断平台和其他环境挑战。在农业方面，生物传感器可以放置在田地或储存地点，并定期检查环境变化的产生指标，例如病原体的存在。

讨论

讨论的所有技术都有可能增强有害生物的检测，并显示出支持植物生物安全和监测的巨大潜力。然而，没有一种技术可以适用于所有情况下的所有害虫。从一开始就采用跨学科的方法对于实现总体目标很重要。将来自不同学科的科学家与利益相关者（检查员、推广人员、工厂和农民）聚集在一起以促进有效的共同创造，将确保所设计的技术适合用途，并应促进对成功至关重要的快速部署轨迹。

本综述中描述的技术的一个显着优势是它们都提供了将诊断从集中参考实验室转移到现场或偏远或设备较差的实验室直接向最终用户提供数据的机会。因此，至关重要的是，现场检查员、农民和其他技术用户必须准备好应对结果并有效地做出快速决策。目前，某些技术存在数据输出复杂且最终用户不易理解的差距。PlantVillage Nuru应用程序等其他技术包括对数据的解释，直至推荐行动。使用智能手机作为将数据转化为可操作知识的一种方法可能会加速发展，这有助于最终用户社区采用新技术。

部署多种技术来创建整体监测系统也可能是一个重要的未来趋势(图6)，因为没有一种技术可以提供实现有效疾病监测结果的所有解决方案。例如，卫星或无人机成像数据可以用来定位正在经历生物和/或非生物胁迫的作物区域。虽然这些数据可能不足以识别单个害虫，但它可以用来引导种植者或检查人员注意受到胁迫的植物，以便进一步分析。在该领域，智能手机技术可以用于筛选大量样本，并根据症状提供诊断。在需要物种或菌株水平信息的情况下，这款智能手机应用程序可以使用高特异性的LFA或DNA技术识别出最好的样本进行测试，从而减少了需要分析的样本数量，并有可能提供应该使用哪些额外测试的“分类”。这一战略将加快决策进程并及时部署缓解措施。

图6

集成技术和结合来自不同平台的数据以实现总体目标，而不是顺序或同时使用它们，也可能是可取的。此外，将害虫数据(存在、丰度、类型、抗性基因型等)与终端用户采取的行动信息(例如，所使用的喷雾计划)及其后续结果(即管理行动的有效性)结合可促进机器学习算法的使用，以修改和改进控制特定害虫的建议行动，最终创建一个“数字农学家”，可以根据数据采取行动，并能够从这些行动的结果中学习。然而，由于所需的计算能力，结合数据以促进复杂的决策可能需要远程数据分析。农村社区缺乏互联网接入可能会阻碍这些方法的采用，这应该得到解决，以最大限度地提高可达性。

自动化对于建立有效的监测系统以提供有害生物存在的早期预警至关重要。最终用户，如农民、检查员和推广人员通常时间不多，期望他们投入大量的时间监测害虫是不现实的，除非是最有价值的问题。这可能会减少使用并推动采用较小的监测网络，从而削弱该系统的成果价值。自动化和无线数据传输的使用应能提高技术的采用率，但也可能产生一种权衡，即时间投入的减少必然导致与自动化系统有关的更多资本支出。

在资本和运行成本方面，可以对各种方法进行区分。有些方法需要购买资本设备（如VOC、图像和光谱分析平台），但对消耗品没有要求或要求有限。因此，前期成本有利于测试更多的样品。其他技术（如LFAs）对资本设备没有要求，而每次测试都会给用户带来成本。最后，有一些方法既有资本成本又有持续的消耗品成本(如DNA方法，如HTS或LAMP)，制造商可以建立一个定价结构。共同创造的过程应设法确定资本和/或运行成本是否会对预期的最终用户形成不可逾越的障碍。

需要进行许多测试的方法常常被用来提供虫害存在/不存在的时间序列或空间表示，而且大部分费用必然来自产生负面结果的测试。只有在病原体存在时才触发的传感器对于这些情况来说是非常有益的。通过模仿植物识别害虫的早期过程，利用合成生物学的方法，这是可以实现的。在自我报告系统中利用这些相互作用将创建一个传感器，只有在有害生物存在的情况下才能报告，在没有害生物存在的情况下，没有持续的消耗品成本。

技术创新正在提供一系列工具，以便能够进行监测，支持生物安全和控制地方病虫害。推动这些工作的是各种进展，包括可用于DNA分析的便携式平台、以有意义的分辨率获取遥感光谱数据以及可用于分析和向最终用户传播信息的智能手机。未来的发展将依赖自动/实时数据收集和完善的解释说明(即行动而非风险)的需要的驱动。其采用将取决于改善与最终用户的接触，以及关于在农业和生物安全方面更多利用监测系统提供的知识的益处的经济数据。

总结

植物病虫害和病原体造成重大经济损失，严重制约农业生产力

技术创新提供了大量工具来支持生物安全和地方性害虫控制的监测

技术集成和来自不同平台的数据组合对于创建整体监控系统至关重要

自动化对于建立有效的监测系统以提供有害生物存在的早期预警至关重要

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