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一种调控百合花期的方法

花匠小妙招
2024-12-19 05:49

专利名称：一种调控百合花期的方法
一种调控百合花期的方法技术领域
本发明属于利用基因工程改造植物生理周期方法的领域，特别涉及一种调控百合花期的方法。
技术背景植物花期是观赏园艺植物的一个重要特征。植物的花期决定了植物的应用范围和商业价值。植物开花是植物由营养生长向生殖生长转型的最重要的一个过程，在合适的时间完成这个转型是植物实现生殖发育所必需的。通过对开花时间的调控，植物才能实现种间同步杂交并产生尽可能多的种子，这是植物在长期进化过程中形成的对环境条件的一种适应。最近十余年来，利用拟南芥为模式植物，对高等植物开花时间调控机理与信号转导途径的研究取得了长足的进步。
目前模式植物拟南芥的开花途径已经研究得比较清楚，由四条途径控制光周其月途径(photoperiod pathway)、自主途径(autonomous pathway)、春化途径(vernalization pathway)和赤霉素途径(GApathway)。光周期途径的关键基因有光受体⑶F/、CRY2, phya琳phyb等，生物钟基因有ZI、CCAl、TOCl、GI、COSTANS等，低温春化途径关键基因有W A^、和等基因，自主途径有/CL4、FY、和FZD等关键基因。低温春化途径基因和自主途径基因共同抑制开花抑制因子^ZC基因的表达。以上这三条途径共同调节开花整合子/T和5OC7的活性，后者进而影响花分生组织基因 APl和ZfF的表达；赤霉素途径则通过赤霉素合成酶基因和赤霉素不敏感基因等直接影响5OC7和的表达。这些开花调控途径既相对独立，又相互影响，共同调控植物花的诱导和发育。
在实际生产应用中，大多针对不同的植物类型采用不同的花期调控模式，如菊花多采取人工短日照处理的方法，还有些花卉采用激素处理来促进成花。在处理过程中还需要植物生长到特定阶段，保持特定的温度和湿度，只有这样才能促进植物良好开花，催花成本比较高。
因此，在实际生产中，需要一种无需激素处理、转化处理过程简单易行、处理后植株养护方便、催花成本低廉的调控花期的方法
发明内容
本发明提供一种调控百合花期的方法，该方法是利用病毒表达载体将拟南芥的 /了基因(Genbank中登陆号为NM105222.2)导入百合中。
本发明的目的是由以下技术方案实现的一种调控百合花期的方法，该方法是利用病毒表达载体将拟南芥/T基因(Genbank 中登陆号为NM105222.2)导入百合中。
所述的百合的品种为新铁炮富田1号。
所述的病毒表达载体导入农杆菌，得到带有所述的病毒表达载体的农杆菌；再将所述的带有病毒表达载体的农杆菌注射入百合小苗的叶片中。
所述的病毒表达载体由质粒载体PGR106构建而成。
所述的病毒表达载体中含有eGFP基因。
所述的导入方法为电击转化法。
所述的农杆菌的菌种为GV3101。
本发明相比现有技术具有以下有益效果本发明是向百合中转入/T基因，充分利用/T是成花素，可以长途运输这一特性，利用FT蛋白促进百合成花；目前的研究结果已经表明植物开花受到成花素的诱导，成花素就是FT及其同源基因所编码的蛋白质，可以长途运输，由产生部位运输到靶标部位最终促进成花。
本发明在处理中没有对植株使用激素，也未涉及到转基因植物，所以没有造成化学药品所带来的环境污染。
本法明的处理过程简单易行、处理后植株养护方便、催化成本低廉。
说明书附1 拟南芥/T基因PCR检测结果；图2 病毒表达载体pGR106-/T结构图；图3 病毒表达载体pGR106-/了在百合叶片中表达的荧光显微镜检测结果；图4 病毒表达载体pGR106-/TPCR检测结果；图5 病毒表达载体pGR106-/T对百合花期的影响。
具体实施方式
实施例1 一种调控百合花期的方法，该方法是利用病毒表达载体将拟南芥/T基因(Genbank 中登陆号为NM105222.2)导入百合中。
所述的百合的品种为新铁炮富田1号，也可以为其他常见百合品种。
所述的病毒表达载体导入农杆菌，得到带有所述的病毒表达载体的农杆菌；再将所述的带有病毒表达载体的农杆菌注射入百合小苗的叶片中。
所述的病毒表达载体由质粒载体pGR106构建而成。
所述的病毒表达载体中含有eGFP基因。
所述的导入方法为电击转化法。
所述的农杆菌的菌种为GV3101。
本实施例是向百合中转入/T基因，是充分利用FT是成花素，可以长途运输这一特性，利用FT蛋白促进百合成花；目前的研究结果已经表明植物开花受到成花素的诱导，成花素就是FT及其同源基因所编码的蛋白质，可以长途运输，由产生部位运输到靶标部位最终促进成花；已经有的研究试验表明/了基因经过PVX病毒携带并在植物中表达可以促进烟草成花。
本实施例在处理中没有对植株使用激素，所以没有造成化学药品所带来的环境污染。
本实施例的处理过程简单易行、处理后植株养护方便、催花成本低廉。4
实施例2 本实施例为病毒表达载体pGR106-/T的构建。
本实施例中的基础材料为FT eGFP基因存在于质粒载体PCR2.1中，该载体的制备方法记载于《FLOWERING LOCUS T Protein May Act as the Long-Distance Florigenic Signal in the Cucurbits》 (William J. Lucas, Section of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, California, The Plant Cell 19:1488-1506 (2007))，该载体带有拟南芥/T基因(Genbank中登陆号为NM105222.2)和eGfiP基因；所述的构建步骤如下A、克隆目的基因并引入酶切位点在质粒载体PCR2.1中，利用克隆拟南芥FT基因的引物序列(Genbank中登陆号为 NM105222.2)，将上下游引物的酶切位点分别换为Clal、Sail,且在下游引物序列中加入终止密码子UAG，再进行PCR扩增获得带有酶切位点Clal、Sail的/Τ.· eGFP基因。
/Τ.· eGfiP基因具体引物序列如下上游引物FT_up2为5，CCG ATCGAT ATG CGG GCC TCT ΑΤΑ AAT3， (含 ClaI 酶切位点) 下游引物FT_down2为5，CA GTCGAC CTA GGT ACC GGA TCC CTT GT3，(含 SalI 酶切位点) PCR反应体系PCR反应的程序设定如下第一步94 °C，4 min ；第二步94 °C，45 s ；第三步60.2 V，1 min ；第四步 72 "C，Imin ；第五步72 °C，7 min ；其中，第二、三、四步重复20个循环；PCR扩增，25 μ 1 PCR反应体系如下在200 μ 1的小离心管中依次加入下列成分质粒模板DNA 1 μ 1 ；Buffer 2.5 μ 1 ；dNTP 2 μ 1 ；上游引物1 μ ;下游引物1 μ ;rTaq 聚合酶0.2 μ ；ddH20 17.3 μ 。
将PCR产物回收后测序，再经序列分析，证明PCR扩增产物确为带有酶切位点 Clal、Sail 的/T: eGFP 基因。
PCR 结果如图 1 所示，M Marker ； 1-2 FT-eGFP 的 PCR 扩增条带；B、构建病毒表达载体pGR106-FT a、酶切将上述带有酶切位点Clal、Sail的FT eGFP基因和pGR106载体质粒，进行Clal、Sail双酶切，再分别回收1.3kb和ll.lkb处的DNA片段。其中，1.3kb处的DNA片段为 FT eGFP基因片段，ll.lkb处的DNA片段为pGR106载体片段。
b、连接将上述回收的FT: eGFP基因片段与pGR106载体片段按3: 1的比例进行连接处理，温度为16°C，时间为Mh，得到连接产物。
DNA连接反应如下 IOXligation buffer 1 μ 1 ； PGR106载体片段2 μ 1 ； FT eGFP基因片段6μ1 ； Τ4 DNA Iigase 1 μ 1 ； Total volume 10 μ 1 ；10 X Τ4 DNA Ligase buffer Tris-HCL 400mM, MgCL2 IOOmM, DTT IOOmM ，ATP 5mM , (PH7.5,25°C)。
将所述的连接产物经过热击转化，导入大肠杆菌DH5CI感受态细胞中，提质粒，经酶切验证正确的载体质粒，送往上海生工测序并验证正确，得到构建好的病毒表达载体pGR106-FT。所述的病毒表达载体pGR106-FT的结构如图2所示。
实施例3 本实施例为所述的病毒表达载体pGR106-FT电击转化导入农杆菌GV3101。
A、农杆菌电击转化感受态细胞的制备a.将-80°C保存的农杆菌GV3101菌液取出解冻，划线接种于LB (含Rif 50yg · ml—1+四环素2yg · ml—1)固体培养基上；b.挑取单菌落接种于3ml液体LB液体培养基(含Rif 50 μ g · ml—1+四环素2 μ g · ml ，在摇床上培养过夜，转速为180rpm，温度为28 V，得到培养过夜的菌液；c.取两个三角瓶，分别盛有100mlLB液体培养基(不加抗生素)，再分别加入0.5 Iml所述的培养过夜的菌液，在摇床上培养，转速为ISOrpm，温度为^°C，时间为3 4h,达到OD600=0.5 1，优选为0.6，得到扩增后的菌液；d.将所述的扩增后的菌液分别装于6个离心管中(30ml/管)，进行离心处理，温度为4°C，转速为4000 rpm，时间为5min;再弃上清液，并倒置离心管1 min，将余液排尽，得到沉淀物A ；e.将所述的沉淀物A中加入1/2体积的10%的预冷甘油，或者是等体积的ddH20重悬，再进行离心处理，温度为4°C，转速为4000 rpm，时间为5min ；f.再弃上清液，得到沉淀物B；将所述的沉淀物B每管用4ml 10 %预冷甘油或者是等体积的ddH20重悬，并合装于两只离心管中，再进行离心处理，温度为4°C，转速为 4000 rpm，时间为 5min ；g.再弃上清液，得到沉淀物C;将所述的沉淀物C每管用2ml10%预冷甘油或者是等体积的ddH20重悬，并合装于一只离心管中，再进行离心处理，温度为4°C，转速为 4000 rpm，时间为 5min ；h.再弃上清液，得到沉淀物D，用1.5ml 10%甘油重悬，得到农杆菌感受态细胞；i.将所述的感受态菌液分装，每管100μ 1，在液氮中速冻，保存在-80°C。
B、质粒转化农杆菌的电击转化将所述的病毒表达载体pGR106-/T转入农杆菌GV3101。
a.从-80°c冰箱中取出所述的农杆菌感受态细胞，置于冰上慢慢溶解。
b.将1 5 μ 1所述的病毒表达载体pGR106_/了加入到40 μ 1所述的农杆菌感受态细胞中，用手指轻轻弹混勻，得到用于电击的菌液；c.将所述的用于电击的菌液转移到冰上预冷的电极杯中，将电极杯放到冰上；d.将电极器设定电压2.5kV，电阻400 ohm，电容25 Mfd ；e.将电极槽从冰上取出，擦干然后按照正确的方向放入，插到最里面，然后同时按 “Bit-Rad”和“genepluse”两个按钮，并一直按到机器发出响声立即放手，时间表显示8 12 msec为合适；f.立即往电极槽里加入1ml LB培养基；g.将电极槽中溶液混勻，然后转移到1.5ml的离心管中，进行培养，温度为28 V，转速为200rpm，时间为45 min，得到电击后的菌液；h.将所述的电击后的菌液离心，弃上清，用枪混勻，涂于四抗平板(Kan50 Ug · mr'+RifSO yg · ml-1+四环素 2yg · ιηΓ1+庆大霉素 40 μ g · ιηΓ1 )，再于 28 °C,培养48h，得到含有病毒表达载体pGR106-/T的农杆菌的菌落。
实施例4 本实施例为病毒表达载体pGR106-FT注射百合。
A、百合幼苗的种植选择吸水性好，土质松软的蛭石和营养土，按重量比2: 1混合，于140°C，高温灭菌4h，得到百合培养土；再将所述的百合培养土分装到8X16孔穴盘中，每孔播种一粒百合种子；播种以后在穴盘上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境；等百合小苗长到1 2片叶子时，移入营养钵每钵一株，置于室温内培养。
B、菌液制备a.在实施例3中所述的含有病毒表达载体pGR106-/T的农杆菌的菌落中，挑取单菌落，于 5 IOml 含卡那霉素 Kan 50 yg · ml _1+Rif50 yg · ml-1+四环素 2yg · ιηΓ1+ 庆大霉素40 μ g · ml 1的LB液体培养基中进行培养，温度为28 °C，转速为200 rpm，时间为18 h，得到四抗菌液；再将所述的四抗菌液按照体积比1 50 100的转接到含有相同抗生素的LB里面进行培养，温度为28 V，转速为200 rpm，直至OD6OO为0.4 1.0，优选为0.6，得到悬浮菌液A ；b.将所述的悬浮菌液A进行离心处理，转速为5000rpm，时间为15 min，温度为室温，弃上清，收集沉淀物；将所述的沉淀物用5 ml渗透培养液(l/2MS+30g/L蔗糖)重悬，然后加上渗透培养液，使OD600至0.4 1.0，优选为0.6，得到用于转化的悬浮液；所述的渗透培养液配方(IL) l/2MS+30g蔗糖；C、注射百合待到百合小苗长到6 8cm高时，用注射器(无针头)将所述的用于转化的悬浮菌液从叶片背面远离主脉处注入1 2ml，注射无菌水为对照；再将注射后的百合小苗置于温室内，定期观察注射过百合苗的变化。
实施例5 本实施例为转入病毒表达载体PGR106-/T的百合的检测。
、PGR106-/T病毒表达载体在百合叶片中的表达
用实施例4中所述的用于转化的悬浮液注射百合叶片后，用注射无菌水的百合叶片作为对照，在荧光显微镜下观察/T-eG^融合基因的表达情况。如图3所示，可以看到对照叶片无绿色荧光；而注射过的百合叶片中，有绿色荧光，并且植株下、中、上部位叶片的荧光表达量依次减少。图3中，A:在荧光下，无菌水注射过的百合叶片(对照)；B:在荧光下，病毒表达载体PGR106-/T注射过的百合下部叶片；C:在荧光下，病毒表达载体 PGR106-/T注射过的百合中部叶片；D:在荧光下，病毒表达载体PGR106-/T注射过的百合上部叶片。、病毒表达载体PGR106-/T的PCR检测
PCR产物琼脂凝胶电泳结果如图4所示，注射病毒表达载体PGR106-/T植株有大小为560bp的目的基因片段，与病毒表达载体PGR106-/T中目的基因片段大小相符。图4中M Marker ； 1 阳性对照；2 阴性对照；3 水空白对照；4_6 注
射植株。C、病毒表达载体PGR106-/T对百合花期的影响
用实施例4中所述的用于转化的悬浮液注射百合叶片后，将百合置于25°C温室生长，培养温度为25-28°C，光照强度为30001ux。2个月以后，可以看到用含pgR106_/T 的菌悬浮液注射过的百合开花了；而对照株还未抽茎，如图5所示。图5中，1 空白对照；2-3 注射了病毒表达载体植株；4 注射无菌水
综上所述，实施例4中所述的用于转化的悬浮液，用注射无菌水的百合叶片作为对照，在荧光显微镜下观察/T-eG^融合基因的表达情况。可以看到对照叶片无绿色荧光出现，而注射的植株有绿色荧光，并且其下、中、上部叶片荧光表达量逐渐减少，2个月以后，已注射百合的花期明显比对照植株提前。实施例1至实施例5中，主要分子生物学试剂DNA凝胶回收试剂盒购自杭州 V-gene生物技术公司；DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、Ex Taq酶、购自宝生物大连有限公司(TakaRa产品)；
实施例1至实施例5中，PCR引物由北京三博远志生物技术有限公司合成；DNA测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。实施例1至实施例5中，所述的PCR反应使用PTC-100 Peltier Thermal Cycler基因扩增仪，购自MJ Research Inc公司；所述的琼脂糖凝胶电泳使用UVP Gel Documentation凝胶分析系统，购自基因公司；所述的琼脂糖凝胶电泳使用DYCP-31DN 电泳仪，购自北京六一仪器公司。实施例1至实施例5中，所采用的PCR、酶切、连接、转化等基因工程基本操作方法记载于《分子克隆实验指南第三版》中((美〕J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版)，和《植物基因工程原理与技术》中(王关林，方宏筠著，科学出版社，1998)。
权利要求
1.一种调控百合花期的方法，其特征在于该方法是利用病毒表达载体将拟南芥/T 基因(Genbank中登陆号为NM105222.2)导入百合中。
2.根据权利要求1所述的调控百合花期的方法，其特征在于所述的百合的品种为新铁炮富田1号。
3.根据权利要求1或2所述的调控百合花期的方法，其特征在于所述的病毒表达载体导入农杆菌，得到带有所述的病毒表达载体的农杆菌；再将所述的带有病毒表达载体的农杆菌注射入百合小苗的叶片中。
4.根据权利要求3所述的调控百合花期的方法，其特征在于所述的病毒表达载体由质粒载体pGR106构建而成。
5.根据权利要求3所述的调控百合花期的方法，其特征在于所述的病毒表达载体中含有eGfiP基因。
6.根据权利要求3所述的调控百合花期的方法，其特征在于所述的导入方法为电击转化法。
7.根据权利要求3所述的调控百合花期的方法，其特征在于所述的农杆菌的菌种为 GV3101。
全文摘要
本发明提供一种调控百合花期的方法，该方法是利用病毒表达载体将拟南芥的FT基因(Genbank中登陆号为NM105222.2)导入百合中；所述的百合的品种为新铁炮富田1号。所述的病毒表达载体由电击转化法导入农杆菌，得到带有所述的病毒表达载体的农杆菌；再将所述的带有病毒表达载体的农杆菌注射入百合小苗的叶片中。所述的病毒表达载体由质粒载体pGR106构建而成。所述的农杆菌的菌种为GV3101。本发明的利用FT蛋白可以长途运输的性质，由产生部位运输到靶标部位最终促进成花；本发明在处理中没有对植株使用激素，也未涉及到转基因植物，所以没有造成化学药品所带来的环境污染；本发明的处理过程简单易行、处理后植株养护方便、催化成本低廉。
文档编号A01H5/00GK102021199SQ20101026356
公开日2011年4月20日申请日期2010年8月26日优先权日2010年8月26日
发明者任霞, 吴忠义, 张秀海, 李双, 黄丛林申请人:北京农业生物技术研究中心