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植物组织培养中常见问题及解决办法

花匠小妙招
2024-12-20 18:08

［目的要求］
认识植物组织培养过程中出现的各种污染、材料褐化现象，掌握其防治办法及应急措施
［知识模块］
异常现象处理——组织培养污染、褐化问题及其解决办法
［教学重点］
植物组织培养各类污染的特征与区分
［教学难点］
应急解决办法
［教学方法］
采用一体化教学方法，教师借用多媒体进行简要的讲授后带学生到培养室与温室实地观察。

第一节组培污染及防治

一、污染来源
1. 真菌：
室内真菌种类主要有芽枝孢霉属、曲霉属、铰链孢霉属、镰刀霉属、青霉属等，春、夏季，尤其是南方的梅雨时节，温暖潮湿，非常适合真菌生长。如果长期使用空调而不注意通风，可引起室内真菌污染。室内有空调比没有空调情况下曲霉菌落数多4倍。
2. 细菌
细菌是无孔不入的微生物，为避免细菌的侵袭，科学家曾尝试用抗微生物材料生产各种用品，但效果不十分理想，因为这些材料虽然能杀死细菌，却充满了化学物质。
3. 组织培养过程中的污染源
（1）户外风大菌类进屋机会多
（2）屋内太潮菌类繁衍多
（3）物品带菌多
（4）屋内不干净
（5）屋内清理带菌组培苗
（6）接种不正确
二、传播途径
（1）户外风传播
菌类细小如尘随风飘散由上下落见湿就长有风就有沙有沙就有尘有尘就有菌菌尘混共存
（2）涡流传播
超净工作台上，摆放物品太多，当无菌风吹过时，就会在物品周围形成涡流群，菌类就会在涡流群中停留，从而降低净化效果，增加污染机会。
（3）接种传播
脏手每只带有细菌4万~40万，干净的手，指甲盖大小也有3200多个细菌。指甲缝可以窝藏30多种细菌。如果手上带菌较多，在操作过程中，就难免有菌落入培养基或植物材料上，而导致污染。另外，不正确操作也会增加污染机率掀盖生硬，灭菌不够，操作过慢等。接种过程应该轻开盖，火灭慢，操作快。
三、预防措施
（1）通风
经常开窗，保持室内空气流通可以使室内真菌数量减少。通风方法简便易行，应多使用。
（2）去湿
保持室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，也可减少真菌生长繁殖。
（3）光照
紫外线能杀灭或抑制真菌生长，对减少室内真菌污染大有好处。
　（4）防霉
污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。
四、污染原因判断及污染苗抢救
（1）若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染，比如培养基灭菌不彻底；超净工作台长时间不换滤网，致使净化能力降低；接种用具灭菌不彻底；操作不正确，动作生硬缓慢，开瓶时间太久，接种台摆放物品杂乱，操作中心在人体范围之内；接种室长期不灭菌，菌类太多。
　（2）若污染菌类是从材料周围长起，则可证明是植物材料带菌引起。可能是接种用具灭菌不彻底，接种时材料被污染；或者是未及时发现污染苗，接种过程交叉感染；
（3）若是外植体，菌类从材料培养基以上部分长起，而不是从培养基先长起，且发生在5天以后，则说明是材料带的内生菌。若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染，原因有是灭完菌后，未剪去两个切口或虽剪但器具带菌；
抢救措施：
（1）真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉，即使仅形成菌丝，菌丝能够达到材料内部，因此，真菌污染是灭绝性的。但若使细菌污染，由于细菌繁殖是靠芽孢，细菌不会弥散整个空间，因此只要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可以用。
（2）用抗生素等杀菌药剂的处理，虽有不少报道，但至今还未发现那种抗生素能够对各种菌都有效，并且常常也会影响植物材料的正常生长分化。另一些药剂，虽有的杀菌效果好，但往往容易引起盐害，也无法利用。

第二节材料褐化及其防止

一、褐化现象
外植体褐变是指在接种后，其表面开始变褐，有时甚至会使整个培养基变褐的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。
二、褐化的主要原因
（1）品种：研究表明，品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异，因此有些品种的外植体在接种后较易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不易褐变。故在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。
（2）生理状态：外植体的生理状态不同，在接种后褐变程度也有所不同。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。
（3）培养基成分：浓度过高的无机盐会使褐化程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐化现象加深。
（4）培养条件不当：例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。
三、防治措施
（1）选择合适的外植体：一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。
（2）合适的培养条件：无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。
（3）使用抗氧化剂：在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外使用0．1％～0．5％的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。
（4）连续转移：对容易褐变的材料可间隔12～24小时的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7～10天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

第三节玻璃化问题及其防止

一、玻璃化现象
定义：当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明状，呈水迹状，这种现象通常称为玻璃化。
危害：
①使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。
②出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此使繁殖系数大为降低。
③呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的。
在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异，当培养基上细胞分裂素水平较高时，容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。
二、防治措施
（1）增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；
（2）减少培养基中含氮化合物的用量；
（3）增加光照；
（4）增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；
（5）降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；
（6）降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。

第四节其他常见问题和解决措施

一、初始培养阶段
1、培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯
可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。
改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。
2、培养物长期培养几乎无反应
可能原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。
改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用2，4-D，调整培养温度。
3、愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状
可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。
改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。
4、愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢
可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。
改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。
5、侧芽不萌发，皮层过于膨大，皮孔长出愈伤组织
可能原因：枝条过嫩，生长素、细胞分裂素用量过多。
改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。

二、继代培养阶段
1、苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高
可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。
改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。
2、苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，微型化
可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。
改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。
3、分化率低，畸形，培养时间长时苗再次愈伤组织化
可能原因:生长素用量偏高，温度偏高。
改进措施：减少生长素用量，适当降温。
4、叶粗厚变脆
可能原因：生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。
改进措施：适当减少激素用量，避免叶片接触培养基。
5、再生苗的叶缘、叶面等处偶有不定芽分化出来
可能原因：细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。
改进措施：适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再生方式。
6、丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽
可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。
改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转接，降低接种密度，更换封瓶纸的种类。
7、幼苗淡绿，部分失绿
可能原因：无机盐含量不足，PH值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照、温度不适。
改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好PH值，调控温度、光照。
8、幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中
可能原因：瓶内气体状况恶化，PH值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当。
改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温度。
三、生根阶段
1、培养物久不生根，基部切口没有适宜的愈伤组织
可能原因：生长素种类、用量不适宜；生根部位勇气不良；生根程序不当；PH值不适，无机盐浓度及配比不当。
改进措施：改进培养程序，选用适宜的生长素或增加生长素用量，适当降低无机盐浓度，改用滤纸桥液培养生根等。
2、愈伤组织生长过快、过大，根茎部肿胀或畸形，几条根并联或愈合。
可能原因：生长素种类不适，用量过高，或伴有细胞分裂素用量过高，生根诱导培养程序不对。
改进措施：调换生长素种类或几种生长素配合使用，降低使用浓度，附加VB2或PG等减少愈伤，改变生根培养程序等。