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Microbiome：宏基因组揭示冻土带、温带草原和热带土壤抗性的特征

花匠小妙招
2024-12-21 04:34

编译：微科盟xlin_w，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读

背景：土壤是抗生素耐药基因（ARGs）的重要存储库，但它们在不同生态系统中的潜在风险以及对人为土地利用所引发的变化的响应尚不清楚。本研究利用宏基因组学方法和具有较好宏数据的数据集，研究了阿拉斯加州冻土带、美国中西部草原和亚马逊雨林三个原生生态系统的土壤DNA中ARG的类型和数量，以及后面两个系统分别向农业和牧场转变的影响。

结果：不同生态系统中ARG均具有较高的多样性（242个ARG亚型）和丰度（0.184-0.242个ARG拷贝数 / 16S rRNA基因拷贝），多重耐药性和外排泵是其主要的类型和机制。共鉴定出10个调控基因，占土壤抗性丰度的13-35%，其中以arlR、cpxR、ompR、vanR和vanS基因为主，并且在所有土壤中均有发现。在3个生态系统的26个土壤宏基因组中，共鉴定出55个非调节性ARGs，占非调节性抗生素抗性组丰度的81%以上。变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）是ARG的主要宿主，10个最为丰富的ARG中有7个都在这3类菌中存在。天然草原土壤和邻近的长期用于耕作的农业土壤相比，ARG多样性和丰度均无显著差异。本研究选择了12个临床上重要的ARGs在序列水平上进行评估，发现它们与人类病原体中的ARGs不同，并且当序列拼接后它们的差异更大。细菌群落结构与抗性谱之间存在显著的相关性，表明抗性谱的差异主要是由细菌群落组成引起的。

结论：本研究的结果确定了可能的背景ARGs（存在于所有26个土壤中），对ARG宿主进行了分类，量化了抗性类别，并提供了极低风险的定量和序列信息，但也揭示了未来可能出现的抗性基因变异。

视频摘要

论文ID

原名：Metagenomic analysis reveals the shared and distinct features of the soil resistome across tundra，temperate prairie，and tropical ecosystems

译名：宏基因组分析揭示了冻土带、温带草原和热带生态系统中土壤抗性的共同和独特特征

期刊：Microbiome

IF：14.650

发表时间：2021.5.14

通讯作者：谷洁&James M. Tiedje

通讯作者单位：西北农林科技大学&密歇根州立大学

实验设计

结果

1 检测ARGs和调控基因

在土壤中共检测到268个ARG亚型，可能对21类抗生素耐药，其中大多数属于抗生素灭活（106个ARGs）和外排泵（93个ARGs）机制（图1）。超过58%的抗性组丰度是由于外排泵基因，而只有16%来自灭活和细胞保护类。共检测到10个调控基因（mtrR、gadX、tetR、mexT、cAMP调控蛋白、arlR、ompR、vanS、cpxR、vanR），占土壤抗性丰度的13-35%。以5个调控基因为主，0.014-0.141拷贝数 / 16S rRNA基因拷贝，且在26个土壤中均有分布。由于调控基因并不直接引起抗性，而且它们增加了定量，因此它们不包括在以下大多数分析中。

图1. 26个土壤宏基因组中ARGs和调控基因的组成。a耐药机制。b抗生素类别。

多重耐药基因最多（占非调节耐药基因丰度的57.1%），共观察到67个亚型，其次是大环内酯-林克酰胺链霉素（MLS）耐药基因，共28个亚型，占非调节性耐药基因丰度的11.2%（图1b）。其中β -内酰胺类抗性基因71个，四环素类抗性基因24个，氨基糖苷类抗性基因20个，分别占非调节耐药基因丰度的2.6%、3.0%和1.6%。

2 所有土壤中均含有的ARGs

不管是天然或是人为因素，所有26个土壤共有55个非调节性ARGs（图2a）。这些共同的ARGs占所有土壤非调节耐药基因丰度的81.5%-98.6%。土壤中都含有的ARGs由9大类抗生素耐药基因组成，但大多数为多重耐药基因（31个亚型，1.7×10-2-6.7×10-1拷贝数/16S rRNA基因拷贝）。所有土壤均含有有6个四环素抗性基因和5个万古霉素抗性基因，它们的抗性丰度为1.0×10-3-1.2×10-2。所有土壤中仅发现2个β -内酰胺类抗性基因，丰度为4.6×10-4-3.8×10-3拷贝数/16S rRNA基因拷贝。氨基糖苷和甲氧苄氨嘧啶抗性基因的浓度在3种生态系统中差异较大，从9.4×10-5拷贝到2.0×10-3数/16S rRNA基因拷贝。外排泵是这55种共同含有的ARGs的主要机制，占总ARG丰度的80.6%。

图2. 三种生态系统土壤ARGs的丰度和多样性。a 26个土壤宏基因组中55个背景ARGs的丰度热图。b不同机制的ARGs的多样性和丰度。c不同抗生素种类的ARG丰度。MLS: macrolides-lincosamides-streptogramines。

3 天然土壤中ARGs

在天然土壤中共观察到242个ARG亚型，覆盖了所有检测到的抗生素耐药基因类别（图2b）。在阿拉斯加冻土带土壤、美国中西部草原土和亚马逊雨林土壤中分别检测到144、191和215个ARG亚型，抗性丰度分别为0.195、0.201和0.243个拷贝/ 16S rRNA基因。天然土壤与人为土壤之间的ARG多样性和抗性丰度无显著性差异（p>0.05）。大部分抗性基因的丰度是由以外排泵复合物组成的基因贡献的，如mdtABC-tolC、acrAB、mexEF-oprN和rosAB（图3a）。天然土壤中万古霉素耐药基因共检测到13个亚型，天然和人为土壤中万古霉素耐药基因差异无统计学意义（p = 0.07）（图3b）。

图3. 三种生态系统土壤中选择的ARGs的丰度。a 外排泵复合体，b万古霉素耐药基因。

4 不同地理位置的土壤抗性组

PCoA分析清楚地表明，土壤抗性谱按地理位置分组（图4a）。冻土带ARG多样性比温带和热带地区低（p <0.01）（图2b），温带和热带地区差异不显著（p = 0.91）。所有在阿拉斯加土壤中检测到的ARGs均在美国中西部和亚马逊土壤中发现。在温带和热带土壤中均观察到140个ARGs，但在冻土带中没有。温带和热带土壤中共同含有87.6%的ARGs，而有27个ARGs仅在其中一种土壤中发现。热带土壤的抗性丰度最高，但差异无统计学意义（p >0.05）（图2c）。普鲁克分析表明，ARG谱与细菌群落结构显著相关（M2平方和= 0.183， r= 0.904， p<0.01）（图4 b）。

图4. 土壤抗性组谱。a PCoA分析显示了三个生态系统中土壤抗性组图谱。圆圈表示原生土壤，三角形表示人为土壤。b 菌群的普鲁克分析和耐药谱。数据点表示土壤样品在抗性组谱中的位置，箭头表示细菌群落结构转化排序中的位置。

5 农业对土壤抗性组的影响

美国中西部天然土壤和长期耕作土壤的ARG多样性和总丰度均无显著差异（p > 0.05）（图2b）。3个采样点耕作土壤的抗性组谱非常相似（图4a）。天然土壤万古霉素抗性基因高于耕作土壤，但差异不显著（p = 0.56）（图3b）。

6 亚马逊雨林改牧过程中土壤抗性的变化

亚马逊雨林转变为牧场显著改变了土壤抗性组谱（Adonis test，R= 0.148，p < 0.05）（图4）。向牧草转化导致牧草土壤中增加了23个ARG亚型。除dfrB2外，所有的ARGs（热带雨林或牧场土壤）的丰度都相对较低，丰度范围为1.8×10-5-3.1×10-4个拷贝/16S rRNA基因。亚马逊牧场土壤的非调节抗性基因丰度比原生雨林土壤低11.8%，但差异无统计学意义（p = 0.06）。

7 从头组装识别ARG宿主

本研究将研究的土壤从头组装，并从中鉴定出77-208个含ARG的序列， N50长度从414-14414 bp。大约81.5%的序列的ARG覆盖率低于30%，只有4个序列包含完整的ARGs（1个catB，1个dfrB2和3个cAMP调节蛋白）。59个ARG亚型的宿主按门进行分类，其中20个为多重耐药基因，7个万古霉素耐药基因，6个β内酰胺抗性基因和5个四环素抗性基因（图5）。变形菌门，放线菌门，厚壁菌门和酸杆菌门是主要的宿主，他们分别携带28、21、11、和9个ARGs。bacA、mdtB、mdtC和多重耐药专座基因的宿主门最广（≥4）。调节基因vanR和vanS位于变形菌门、厚壁菌门和放线菌门。

图5. 在门水平上显示已识别的ARGs宿主的网络。不同的颜色代表不同类型的ARGs。

8 土壤抗体组中临床ARGs的检测

由于上述组装的ARGs大部分是多重耐药基因和调节基因，在PATRIC数据库中未被识别，因此本研究针对12个已检测到且在临床中具有重要意义的基因进行序列水平的评估。在亚马逊热带雨林和草场土壤中，这些基因包括2个β内酰胺类（ampC和FEZ-1），1个喹诺酮类（mfpA），3个氨基糖苷类（aac（2’） - I， aac（6’） -I和aph（6’） - I）和6个四环素抗性基因（图6）。除mfpA外，在所有12个ARGs中均检测到与临床相似的读长，氨基酸识别阈值为80%。其中，超过74%的FEZ-1、aac （2’） - I、tetC、tetO和tetV读长与其临床类型具有相同的氨基酸水平。只有6个ARGs序列相似性达到90%。FEZ-1、tetC和tetX的临床ARG序列高度相似（97%的同源性），但它们仅占其环境（临床和非临床）丰度的0.9-4.4%，且没有一个序列与临床病原体中的ARGs序列相同。在亚马逊雨林和牧场土壤中，tetV是最丰富的临床ARG，丰度分别为4.1×10-4和2.4×10-4拷贝数/16S rRNA基因。亚马逊雨林和牧场土壤在所有选定的识别水平上，临床ARGs的丰度均无差异无统计学意义（p>0.05）。与临床相似的ampC仅在90%的亚马逊牧场土壤中检测到，但其丰度低至每16S rRNA基因5.3×10-7拷贝/16S rRNA基因。

12个选择的ARGs中只有3个（即：ampC、tetM和tetO）可以用更敏感的目的基因工具进行组装。组装的ampC仅在亚马逊森林土壤中发现，且与临床ampC基因具有46-56%的氨基酸相似性。组装的tetM和tetO与在人类病原体中发现的临床类型有62-71%和69-74%的相似性。与SARG分析的结果一致，亚马逊森林土壤和草地土壤的组装的tetM和tetO丰度没有显著差异。

图6. 亚马逊雨林和牧场土壤中12个临床ARGs的丰度。蓝色柱代表SARG数据库量化的ARG丰度。黄色和红色柱表示临床ARGs的丰度分别为80%、90%、95%和97%。黑色线条是标准误差。

9 土壤中ARG簇的识别

网络分析用于识别所有土壤中存在的ARG簇。本研究发现，尽管地理位置相距较远，生态系统存在差异，以及是否有人为活动，但多种基因广泛共存。一共有8种ARG簇被识别，包括12类抗生素的67个ARG亚型。共同存在的ARGs多为多重耐药基因（27个亚型），其次为四环素耐药基因（9个亚型）和β内酰胺类耐药基因（8个亚型）。在ARG簇中发现4个氨基糖苷类抗性基因，它们与其他ARGs的平均相关性最高，相关率为4.8。最大的ARG簇由25个ARGs组成，其中ThinB和aac（3）-IV分别是连接其他10个和9个ARGs的枢纽基因。

讨论

在阿拉斯加苔原、温带草原和热带生态系统中，土壤抗性组的多样性和丰度很高，这支持了ARGs在自然中无处不在且在不同的陆地生态系统中广泛存在的观点。在天然土壤中检测到的ARGs包括那些可能对所有用于治疗人类和动物的主要抗生素产生耐药性的ARGs，如β内酯类（LRA、PER、TEM和OXA基因）、大环内酯类和林克酰胺类（erm基因）、喹诺酮类（qepA）、氨基糖苷类（aac和aph基因）和四环素类（tet基因）。ARGs自然存在于天然土壤中并不奇怪，因为许多抗生素是由土壤微生物产生的，而且确实是药品的原始来源。根据研究者的观察，之前的研究还从未受干扰的阿拉斯加土壤中发现了不同的β内酰胺酶抗性基因和一个新的氯霉素抗性基因。万古霉素被认为是抵抗MRSA菌株的最后一道防线，但在这些原生土壤中发现了13种万古霉素耐药基因亚型，包括临床病原菌金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌中发现的vanH、vanA和vanX。类似地，D’Costa等人在3万年的冻土沉积物中检测到了3个万古霉素基因，进一步分析证实了古代vanA与现代变种在结构和功能上的相似性。研究者通过ARG宿主分析显示vanH、vanA和vanX被产万古霉素的放线菌所包藏。

本研究鉴定出55个结构型ARGs和5个调控ARGs，且在不同生态系统类型和地理位置的土壤均含有这些ARGs，因此它们是潜在的常见或“背景”土壤ARGs。在之前的研究中，这些ARGs也出现在各种陆地生态系统中。本研究在水稻土中检测到了30个背景ARGs；其中10个在旱地（花生）土壤中发现;至少在温室土壤中发现了16种，在南极土壤中发现了10种。共有的ARGs多为多重耐药基因，外排泵为其主要机制。例如，11个背景ARGs参与了Mex-Opr外排泵系统，它们在革兰氏阴性菌的多重耐药中发挥了关键的作用。AcrAB外排泵起抽出胆汁酸、脂肪酸和各种有毒化合物的生理作用。因此，研究者认为在评估土壤环境中ARG的风险时，应该将这些普遍含有的通常风险较低的ARG视为一个单独的类别。然而，这并不意味着背景ARGs是无风险的，因为一些ARGs已经在质粒中被发现，可以通过人为活动富集。例如，macB很容易被移动元件获得，从而传播大环内酯类耐药。污泥和鸡粪对土壤中背景ARGs acrA、vanC和mexF的富集显著。这些结果表明，与ARG的丰度相比，评估ARG的移动性可能对评估ARG的风险更为重要，因为ARG转移到病原体中是一个主要的危险因素。

土壤抗性谱具有明显的地理模式，其模式大于土地利用导致的变化。冻土带ARG多样性与细菌多样性之间存在显著的相关性（p < 0.01， R2= 0.795），说明细菌多样性的降低可以解释冻土带ARG多样性的降低。Wang等检测到南极土壤细菌香农指数与ARGs香农指数呈正相关（R2 = 0.39， p= 0.0001）。相反，ARG丰度与细菌多样性之间无显著相关性（R2 = 0.152），这与Bahram等对全球表土样品（189个点，7560个亚样，12个生态系统）微生物组进行研究发现ARG丰度与细菌多样性之间存在显著负相关关系的研究结果不一致。这种不一致可能是由于土壤性状、植被、土地利用历史以及包含哪些基因等方面的差异造成的。例如，Bahram等人的研究使用ARDB对ARG进行注释，分析中包括vanR和vanS等调控基因，而本研究的分析中排除了所有调控基因。抗性谱与微生物群落结构之间存在显著相关性，说明ARG谱的差异主要是由细菌组成决定的。这与以往发现不同环境下ARG谱与细菌群落结构有很强的相关性的研究结果一致。因此，不同地理位置的土壤抗性组的变化可能与不同的植被、气候和土壤pH、土壤有机质等因素有关，这些因素会选择不同的种群（从而选择它们携带的ARGs）或通过它们的替代功能选择某些ARGs。

众所周知，人类活动的选择性或共选择性压力的引入是ARGs在土壤中富集的主要原因。例如，用再生水灌溉可使60个ARGs富集。与无机肥料相比，长期施用猪粪显著提高了tetL、tetB（P）、tetO、tetW、sul1、ermB和ermF的丰度。然而，作物生产等正常农业活动是否影响土壤抗性尚不清楚。在本研究中，长期连续栽培的ARG多样性和抗性丰度均未见明显变化。然而，来自中西部三个地点的栽培土壤往往具有相似的抗性谱，这可能是由于细菌群落对农艺生产的类似适应选择。耕作制度类型、施肥和其他土壤管理措施被认为是影响土壤抗性的因素。在这些研究地点，抗生素和重金属没有使用，所以外部因素不会提供选择。总体而言，本研究结果表明，美国中西部的标准耕作和施肥措施（主要是犁板犁、无机氮磷钾和低水平的肥料，如放牧牛）并没有增加土壤中ARGs的公共健康风险。亚马逊森林退耕还草后，出现了23个新的ARGs，ARGs的富集和衰减均有。由此推测草地植被（Urochloa brizantha， Urochloa decumbens， Panicum maximum）和/或放牧（包括它们的粪便）可能通过选择不同的微生物种群和/或增加它们的多样性导致了ARGs的变化。

越来越多的证据表明，病原体中的一些ARGs是通过水平基因转移从环境细菌中获得的。例如，CTX-M扩展谱β内酰胺酶起源于环境属Kluyvera的染色体基因，在环境杆菌中发现了临床vanA。因此，本研究选择了12个在临床中具有重要意义且能够在细菌间转移的ARGs，评估了它们与人类病原体中临床ARGs的序列相似性。本研究在亚马逊土壤中检测到的ARGs与在人类病原体中发现的ARGs不同，这意味着在天然土壤抗性组中大多数ARGs是没有问题的，或者至少还没有进入临床领域。只有少数与临床相似的读长（>90%氨基酸相似性），但进一步对靶基因集合的评估证实，大多数靶基因都与这些基因的保守区域一致。例如，ampC编码临床重要的头孢菌素酶，使其对头孢菌素、头孢唑啉、头孢西丁和大多数青霉素产生耐药性，但在亚马逊土壤中组装的ampC与在人类病原体中发现的相似度不到54%。值得注意的是，大多数研究者使用基于短读长的BLAST进行ARG搜索，它提供了敏感的检测，但也会导致得到结果为非功能性的伪基因或保守域。相比之下，用组装的基因进行ARG评价会遗漏一些低丰度的ARG，但可以更好地反映潜在功能ARG的存在、丰度和序列相似性。

在本研究的土壤中，大约每10个细胞中就有一个ARG（假设土壤细菌每个细胞有2.2个16S rRNA基因拷贝）。尽管ARGs具有较高的抗性丰度，但大多数ARGs不能通过从头组装得到很好的组装效果。这是因为9-17个ARGs贡献了80%的土壤抗性丰度。在10000个细胞中，约有50- 69%的ARG亚型数量少于1。本研究使用NonPareil估计了本研究的土壤序列数据的平均覆盖率，结果表明，温带和热带土壤群落的95%丰度加权平均覆盖率需要大约1.6-11.4 Tb的序列数据。这些结果表明了土壤微生物的遗传复杂性，因此很难利用Illumina短读长在现有资源下组装更多的优势ARGs。例如，本研究检查了vanS调控基因的覆盖范围，发现其位置分布不均匀。从NR数据库中进一步注释为vanS的BLASTX序列显示，大部分读长是HAMP结构域（存在于组氨酸激酶、腺苷酸环化酶、甲基接受蛋白和磷酸酶中）。HAMP结构域长约50个氨基酸，通常存在于整体膜蛋白和双组分调节系统中。这表明，至少部分来自短读长序列的抗性丰度可能包含保守的蛋白结构域，这可能会导致高估了ARGs的丰度。

值得注意的是，SARG数据库和广泛使用的CARD数据库中都包含了一些调控基因。由于调控基因只控制ARGs的表达，而不只是控制ARGs，因此是否应该将调控基因算作ARGs是一个问题。例如，vanR和vanS不能产生万古霉素抗性，但vanR被vanS激活后可以促进vanA、vanH和vanX的共转录。本研究检测到大量的调控基因，它们在不同生态系统的土壤中存在差异（图2b，c）。由于ARGs的潜在风险很大程度上来自编码功能蛋白的结构基因的水平转移，所以本研究将调控基因从进一步的分析中移除。除了调控基因外，一些ARG是功能复合物的组成部分，单个ARG在没有其他ARG的情况下无法编码抗生素耐药性。例如，本研究研究中检测到的许多ARGs是mdtABC-tolC、acrAB - tolC和mexEF-oprN外排泵复合物的组成部分。因此，加入属于复合物的ARGs可以使总抗性丰度增大。

当然，土壤是ARGs的重要储存库，它含有可能有也可能没有问题的背景ARGs，可能含有尚未出现的ARGs和临床ARGs，最有可能是由于人类或动物粪便处理进入土壤。本研究建议更多地关注抗性功能所需的ARG基因或基因集，以及它们相对于普通ARG背景的状态、与可移动遗传元件的相关性以及它们与宿主群体的对应关系或联系。序列相似性可能或可能不指示潜在的ARG功能，但它是说明ARG是否来源于已知的临床耐药性的一个重要的指标，并可通过针对临床基因变异的方法检测。

结论

土壤中含有可能有问题也可能没有问题ARGs，以及一些尚未出现的ARGs。研究表明，土壤中ARG库具有全球性、巨大且具有明显的地理分布模式。本研究在这些不同生态系统的所有样本中发现了55个结构性ARGs和5个调节性ARGs，并建议将这些可能的背景ARGs作为健康风险评估的单独类别。此外，土壤ARGs与人类病原体中常见的ARGs具有低序列相似性。鉴于ARG基因相对于普通ARG背景的状态、它们与可移动遗传元件的关系以及它们与宿主群体的对应或联系，本研究建议在评估风险时，应更多地关注耐药功能所需的ARG基因或基因集。

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