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南京土壤所：种间邻居通过调节根内生微生物群落结构促进花生生长

花匠小妙招
2024-12-21 11:26

植物已经进化出通过改变形态表现和重塑地下微生物群来响应种间邻居的能力。然而，邻近植物是否影响宿主根部的微生物定殖并进一步影响宿主的性能尚不清楚。本研究利用16S rRNA高通量测序技术，对5年多的单作和间作花生(Arachis hypogaea L.)根系进行研究，发现邻近玉米可以改变花生根系微生物组成并重塑根系微生物群落组装。玉米种间共存增加了间作花生根系中慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和链霉菌属(Streptomyces)的定殖。通过内生细菌分离和分离菌接种实验，证实了慢生根瘤菌和链霉菌在有效养分积累和植物激素生产方面的功能潜力使它们成为微生物网络中的关键微生物，在竞争环境中有利于花生的生长和生产力。本研究的结果支持植物通过根部选择性过滤建立植物-内生微生物共生体以增强宿主竞争优势的观点，并为开发利用作物微生物群促进可持续农业的作物生长和生产力的现代多元化种植提供新方向。

编译：微科盟莫扎她一，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

实验设计

结果

1 邻近的玉米影响田间花生的生长

花生与玉米共同种植时，株高、根长和生物量分别比单作花生高11.1、62.8和22.0%(P＜0.05;表1)。结果表明，间作花生的单果重增加35.6%以上(P＜0.0001)。随着花生生物量的增加，间作花生组织中磷含量比单作花生增加26.2%(P＜0.05;表1)。虽然两种种植系统花生的植物氮和碳含量没有差异(P >0.05)，但由于花生生物量的提高，植物总碳、氮和磷增加(P<0.001)(表1)。

植物生理性状往往依赖于植物激素水平的变化。因此，我们评估了地上(包括叶和地上部)和地下(包括根)组织的植物激素状况(图2和补充图2)。与花生生理性状一致(表1)，间作花生中IAA、GA1和tZ等促生长激素水平显示，间作花生的地上组织和地下组织至少高于单作花生43.88%和30.53%(P<0.05;图2A-C)。其他3种促生长激素GA3、GA4和油菜素内酯(Brassinolide)表现出相同的趋势，但处理间GA4和油菜素内酯存在显著差异(补充图2A-C)。同样，间作花生地上和地下组织中SA、JA和Me-JA等防御性植物激素的含量高于单作花生，但花生根系中SA含量的差异不显著(图2D-F)。间作花生根系中ACC和ABA含量平均下降幅度分别为16.46和68.60%(P<0.05;图2G, H)。

图1 无菌培养和土壤培养幼苗外源接种分离菌。(A)无菌培养时接种外源细菌。(B)土壤培养中接种外源细菌。对于无菌培养和土壤培养(A,B)：对照(水)；无菌(处理i)和土壤培养(处理I)花生接种慢生根瘤菌EB56；无菌(处理ii)和土壤培养(处理II)花生接种链霉菌EB47；无菌(处理iii)和土壤培养(处理III)花生分别联合接种EB56和EB47混合物。Br，Bradyrhizobium EB56；St，Streptomyce EB47；BS，EB56和EB47的组合。

表1 单作与间作花生生理特性研究。

*TC，总碳；TN，总氮；TP，总磷。值表示为平均值(n=6)±标准差(SD)。加粗的P值表示差异显著(Mann-Whitney U检验)

图2 检测花生组织中的植物激素水平。采用Mann-Whitney U检验进行统计分析。显著性差异如下标记：*P < 0.05，**P < 0.001，***P < 0.001；ns，没有显著差异(n=6)。(A)吲哚-3-乙酸；(B)赤霉素A1；(C)反式玉米素；(D)茉莉酸甲酯；(E)水杨酸；(F)茉莉酸；(G)脱落酸；(H) ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)。PP，花生单作处理；MP，花生/玉米间作处理。

2 花生根系微生物群落的多样性与组成利用Shannon、均匀度和丰富度指数对植物根系细菌α多样性进行了评估。间作改变了两种植物根系细菌的α多样性，间作花生细菌多样性最低，而间作玉米细菌多样性最高(图3A-C)。单作花生和玉米的根之间没有发现差异(图3A,B)。基于Bray-Curtis距离进行主坐标分析(PCoA)研究根系微生物群落β多样性。正如我们所预期的那样，根系微生物群落根据植物种类和邻近效应分为四组(图3D)。花生根系微生物群落沿第2主成分方向分离(PCoA2=20.31%；PPERMANOVA =0.004;图3d;补充表1)。相比之下，玉米根系微生物群通过种植实践沿第一主成分分离(PCoA1=39.89%; PPERMANOVA =0.005)。与单作玉米相比，间作玉米的细菌群落更接近于单作花生根系微生物群落(单作玉米R2 =0.54，间作花生R2=0.44；两者P < 0.05；补充表1)。MPpr的NDV值高于PPpr，表明确定性(植株选择)过程对间作花生的影响较大(图3E)。花生和玉米根中，放线菌门(Actinobacteria)、γ-变形菌门(Gammaproteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和α变形菌门(Alphaproteobacteria)的丰度相对较高(平均相对丰度>10%;图3F;补充图3)。在这些优势门中，间作花生根系中放线菌门和酸杆菌门的相对丰度增加，而γ-变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度减少(P<0.05;补充表2)。此外，间作导致玉米根系中放线菌门丰度较低，而δ变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门(Chloroflexi)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)丰度较高(P＜0.05;补充表2)。内生α-变形菌的相对丰度不受植物物种或邻居共存的影响(P>0.05；补充表2)。

图3 单作和间作系统中根系内生微生物的α和β多样性。单作和间作处理的根系微生物群落(A)Shannon指数、(B)均匀度指数和(C)丰富度指数。误差条为均值±SD(n=6)。基于Tukey’s HSD检验进行单因素方差分析(ANOVA)，不同字母表示差异显著(P＜0.05)。(D)基于样品间Bray-Curtis距离的根内生微生物主坐标分析(PCoA)。(E)用于指示内生微生物群落组装差异的丰度β-null偏差。(F)单作和间作处理下花生和玉米根系中门水平细菌分布。PPpr，花生单作处理中的花生根系微生物群；MPpr，间作处理中的花生根系微生物群；MMmr，玉米单作处理中的玉米根系微生物群；MPmr，间作处理中的玉米根系微生物群。

3 花生根系内生微生物共现网络

我们构建了共生网络来确定花生根系中细菌潜在相互作用的差异。总体而言，作物种植对内生微生物网络的影响显著：经验网络的平均聚类系数(avgCC)、平均路径距离(GD)和模块性指数均大于相同规模的随机网络(表2)。间作花生根(MPpr)图密度(D)、平均度(avgK)和avgCC值低于单作花生根(PPpr)，说明间作花生根中细菌共现网络更简单(图4A,B和表2)。相邻玉米的存在导致间作花生共生群落中正相关边数显著减少，负相关边数略有增加(图4A,B和表2)。因此，我们观察到MPpr中正:负边数比几乎是PPpr中的9倍(表2)。然后，我们使用模块内(Zi度)和模块间(Pi度)连接来识别可能在微生物网络中起到关键作用的重要节点(代表OTUs)。在单作和间作花生根系网络中识别出5个关键节点，包括1个模块hub和4个连接者(图4C和补充表3)。在PPpr共现网络中，模块hub(OTU114)隶属于α变形菌门的Novosphingobium。在MPpr共现网络中，4个连接者(OTU3045、OUT454、OTU1222和OTU223)分别隶属于α变形菌门的慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和放线菌门的链霉菌属(Streptomyces)、Actinospica和Amycolatopsis(图4C和补充表3)。

利用线性判别分析效应大小(LEfSe)在单作(45个)和间作(23个)花生根系内生菌群落中共检测到68个生物标志物(补充图4)。在前10个代表性生物标志物属中(LDA>2.0，P <0.05)，Novosphingobium(g_Novosphingobium OTU114，作为PPpr微生物网络的模块hub，图4A)在PPpr中排名第四(用三角符号标记)(图4D)，链霉菌属和慢生根瘤菌属(g_Streptomyces OTU454和g_Bradyrhizobium OTU3045，作为MPpr微生物网络中的连接者，图4B)在MPpr中排名第一和第八(标有星形符号)(图4D)。

图4 细菌共现网络构建与生物标志物检测。(A,B)单作和间作处理中花生根系微生物群的微生物网络。连接表示PPpr(A)和MPpr(B)网络中的强(阈值Person > 0.8)和显著(P < 0.01)相关关系。LEfSe分析在单作和间作花生根中发现的生物标志属的节点根据属着色，其他节点为灰色。节点的大小显示了属的丰度。为了区分PPpr中的模块hubs和MPpr中的连接者，代表模块hubs和连接者的节点分别用黄色和浅蓝色圆圈突出显示。直接连接到生物标志属的连接线被着色：红色连接表示两个独立节点之间的正相互作用，而蓝色连接表示负相互作用。(C) Zi-Pi图显示单作(A)和间作(B)网络核心属的分布。(D)根据LEfSe分析确定单作和间作花生根中属水平的细菌生物标志物。每种处理的前10个代表性生物标志物以属水平显示。生物标志物旁边的三角形和星形符号表示这些属分别是PPpr和MPpr共现网络中的关键微生物。

表2 各处理中根系微生物群分子生态网络的拓扑特性。

*PPpr，单作处理中的花生根系微生物群；MPpr，间作处理中的花生根系微生物群。

4 间作花生根系细菌的分离与功能检测

为了确认花生根系中特定属的潜在功能，我们从间作花生根系中分离出117株内生细菌(图5A)。这些分离菌主要隶属于5个门，包括厚壁菌门(49.3%)、放线菌门(20.3%)、γ-变形菌门(16.7%)和α-变形菌门(6.5%)，这与16S高通量测序数据中观察到的优势门(如放线菌门、γ-变形菌门、和α-变形菌门)部分一致(图5B)。主要区别在于分离菌中厚壁菌门的比例较高，这可能是由于特定的培养基选择所致。根据系统发育分类，14个分离菌属可与高通量测序相匹配。然后，我们使用Pearson r来寻找可能促进植物生长的属。其中9个匹配的属显示出与至少一种植物激素显著相关(图5C)。值得注意的是，链霉菌属和慢生根瘤菌属与植物生长促进激素(IAA和tZ)和/或防御性激素(SA和JA)呈正相关，而与ABA呈负相关(图5C)。

基于微生物网络和细菌潜在功能选择的结果，我们针对链霉菌属和慢生根瘤菌属两个属进行后续验证。总体上，我们有8个分离株属于链霉菌和1个分离株属于慢生根瘤菌(补充表4)。所有分离株均能产生IAA和细胞分裂素(补充图5A、B)，并能在NBRIP培养基中生长(补充图5C,D)。8株链霉菌中，菌株EB47的IAA和细胞分裂素产量最高，P动员能力也相对较高(补充图5D)。因此，我们选择链霉菌EB47和慢生根瘤菌EB56进行进一步的培养实验。

图5 间作花生根系中分离的可培养细菌信息。(A)显示117株异养细菌分离株系统发育关系的进化图。标签代表了具有代表性的序列ID。内圈表示菌株属水平分类。外圆表示分离株的门水平分类。(B)饼图显示了16S rRNA基因高通量测序数据(左)和细菌分离株(右)的不同门的比例。(C) 16S rRNA测序中间作花生根系相对丰富的核心属(与分离株一致的属)与植物激素浓度的Spearman相关热图。这些关系是基于Spearman相关性计算的。蓝色~红色代表核心属相对丰度与激素浓度的关系由负向正(Pearson r值为-1~1, P＜0.05)。交叉线框表示与激素浓度相关性不显著的属的相对丰度。

5 外源接种细菌促进花生生长

无论是在无菌培养还是土壤培养中，外源细菌接种都影响了花生生长促进和防御性激素的产生(图6A,B)。无菌幼苗对单菌外源接种(尤其是链霉菌)的大部分植物激素反应比联合接种更强(P＜0.05;图6A)。但当花生在土壤中生长时，植物对联合接种表现出高激素反馈(P <0.05;图6B)，除了IAA(P >0.05;图6B)。结果，接种菌株的植株的株高、根长和根瘤数等生理特征均显著高于对照(图6C)，但植株生物量没有显著差异(补充图6A,B)。同时，与对照相比，联合接种处理的植株碳、氮、磷含量更高(图6C和补充图6C)。这些盆栽试验结果与田间间作花生生长和激素反应一致(图2和表1)。

此外，我们还对外源接种后的花生根系微生物群落进行了研究。有趣的是，细菌接种对微生物α多样性没有影响(P＞0.05;图7C)。同样，单菌接种和联合接种处理的根系微生物组成呈现重叠集群(PPERMANOVA >0.05；图7D；补充表5)。这意味着外源细菌接种可以短暂促进植物生长，但对根系微生物的定殖没有持续影响。

图6 外源接种分离菌对花生生长的影响。(A)外源接种分离菌后检测无菌培养花生幼苗的植物激素水平。(B)外源接种分离菌后检测土壤培养花生幼苗的植物激素水平。(C)外源接种分离菌后土壤培养幼苗的生理特性。误差条是平均值±SD(n=6)。基于Tukey’s HSD检验进行单因素方差分析(ANOVA)，误差条上方的不同字母表示差异显著(P＜0.05)。IAA，吲哚-3-乙酸；GA1，赤霉素A1；tZ，反式玉米素；SA，水杨酸；JA，茉莉酸；CK，对照；Br，接种Bradyrhizobium EB56的花生幼苗；St，接种Streptomyces EB47的花生幼苗；BS，接种EB56和EB47组合的花生幼苗。

图7 外源细菌对花生根系内生微生物的刺激作用。细菌(A)Shannon，(B)丰富度，(C)均匀度。误差条表示平均值±SD (n=5)。基于Tukey’s HSD检验进行单因素方差分析(ANOVA)，误差条上方的不同字母表示差异显著(P＜0.05)。(D)基于Bray-Curtis距离的不同处理间根系内生微生物群落主坐标分析(PCoA)。Br，Bradyrhizobium EB56；St，Streptomyces EB47；BS，EB56和EB47的组合。

讨论

1 间作花生的生理响应

作为一种可持续的农业实践，豆科-谷物间作已被广泛报道，以支持养分循环和作物产量。与之前的研究一致，我们发现间作玉米能使间作花生获得更多的养分(表1)。Li等人的研究表明，豆科植物和玉米根系异质性分泌物的释放可以促进固氮并调动土壤磷以供宿主获取。间作花生获得的养分越多，花生生物量和果重越高(表1)。植物激素在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。间作花生组织中IAA、GA1和tZ等促生长激素水平较高，与田间花生生长情况一致。众所周知，IAA、GA和tZ分别调控根系发育、地上部伸长和细胞分裂。因此，这些植物激素水平的提高可能是花生产量提高的重要内因。与此同时，间作花生组织中的防御性激素(SA、JA和Me-JA)增加(图2)，说明邻近种间植株刺激了花生的防御系统以适应环境。

2 邻近玉米对花生根系微生物组成及组装的影响

除了宿主自编程的生理代谢外，微生物入侵和定殖也会改变宿主植物激素的表达和植物性能。种内和种间邻居分别驱动局部植物根际微生物群趋同和分化。在本研究中，我们观察到邻近玉米通过花生的生境过滤增强了确定性过程(图3E)。这种增强的根系选择导致间作花生根系微生物群α多样性降低(图3A-C)。有趣的是，玉米根系对种间邻居的响应与花生完全相反(图3A-C)，说明植物基因型之间微生物群落的过滤策略不同。此外，我们发现MPpr微生物组成的重复比PPpr集群更紧密，甚至MPpr的玉米根系微生物群与花生(PPpr和MPpr)集群更紧密(图3D)。之前的研究表明，花生在竞争胁迫下可在地下产生气态乙烯。这些气体信号在土壤中具有广泛的扩散性，因此影响范围很广，并可能导致花生和玉米根系中相对同质的内生植物群落定殖。

3 邻近玉米简化了花生根系微生物共现网络

群落中的微生物不是孤立的，而是形成复杂的生态相互作用网络。基于计算方法的微生物共现网络分析为研究微生物网络中各种类型的关联和识别潜在的关键生物提供了一种有前景的方法。在本研究中，与单作花生相比，间作花生根系细菌形成的网络连接更少且更简单。(图4和表2)。Xiong等人证明了宿主选择的强度决定了微生物多样性和网络复杂性。由于玉米的竞争，花生表现出了更强的根系微生物群落选择，从而降低了网络复杂性(图3A-C, 4A,B)。在微生物网络中，核心微生物群(包括模块hubs和连接者)扮演着介导微生物组装的角色。间作花生微生物网络的四个关键微生物(图4B,C)中，慢生根瘤菌已被证明具有固氮作用，其在土壤微生物群落组装中的重要性已被广泛报道，这可能是因为它们能够为微生物消费者提供营养资源。链霉菌、Actinospica和Amycolatopsis属于放线菌，这是一种细菌类别，已经成为高度多样化的抗生素的来源。天然抗生素的产生可能导致间作花生根系中负相关性增加(图4B和表2)。间作花生根际中也观察到参与重塑微生物群落的同纲物种(放线菌)。而在单作花生根中，Novosphingobium是微生物群落构建的关键(图4A,D)。据报道，Novosphingobium能够分解含有苯环的有机物。单作花生根系周围化感物质(如酚酸)的积累可能导致Novosphingobium富集。

4 慢生根瘤菌和链霉菌促进花生生长

宿主植物与定殖菌建立相互共生关系，提高环境适应性。本研究通过细菌接种实验发现慢生根瘤菌和链霉菌这两个重要的属在间作花生中作为生物标志物(图4)。与Chaparro等人的研究一致，当没有对田间进行外部施肥时，这些有益属也被发现是宿主植物发育过程中网络中的关键连接节点。慢生根瘤菌属和链霉菌属的分离株在体外能产生植物生长激素，增加P动员(补充图5A,B,D)。虽然它们的N2固定能力需要通过N2固定基因(如nif基因)论证和乙炔还原来证实，但它们在无氮培养基中生长(补充图5C)表明可能存在非共生固氮活性。因此，这些有益微生物在宿主根系定殖不仅可以扩大植物获取营养物质的途径，还可以帮助植物调节生长和生产所需的激素水平。在本研究中，邻近玉米诱导了更多的微生物定殖花生根系。这可能与玉米特异性分泌物有关，Li等人研究发现，玉米根系分泌物可上调豆科植物的关键结瘤基因，而小麦根系分泌物则不能。我们的研究结果也揭示了邻近植物同一性在根内生定殖选择中的重要性。此外，值得注意的是，虽然外源功能菌的应用可以提高花生植物激素水平，改善宿主生理特性(图6)，但不会引起在花生根系上定殖的微生物群落的改变。这意味着我们不能通过简单的高剂量外源性接种来改善这些有益细菌的宿主定殖。因为外源细菌在土壤中的生态位经常被其他优势微生物物种所取代。由于没有特定的邻近效应，这些细菌的栖息地(如土壤)很容易被本土微生物占据，导致植物生长促进不可持续。许多研究证实，外源功能性细菌在与本土土壤微生物群竞争时处于劣势，导致其灭绝。这也是土壤微生物菌剂应用开发面临的挑战。本研究表明，利用种间植物邻近效应改变细菌群落定殖并在植物-微生物共生体水平上优化宿主适应性，将为农业可持续发展提供新的途径。

结论

本研究发现，邻近玉米通过调节花生根系内生微生物群落的组成和组装来促进花生的生长和产量。种间邻居通过较高丰度的慢生根瘤菌和链霉菌诱导花生定殖，这两种菌都能够产生促进生长的植物激素并调动磷资源。这些菌属在间作花生根系内生微生物网络中也起着重要作用。外源接种这些细菌可提高促生长激素和防御性激素水平，增加养分积累，从而促进植物生长；但接种不能改变根系微生物定殖。本研究为集约化农业系统中通过合理间作策略调控根系相关微生物提供了新方向。