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莴苣叶疫病和茎腐病的病原

花匠小妙招
2024-12-23 06:25

莴苣是菊科莴苣属一年或二年生草本植物，广泛种植于世界各地，特别是温带和亚热带地区；栽培莴苣按产品器官可分为叶用莴苣Lactuca sativa和茎用莴苣L. sativa var. angustata，叶用莴苣也称生菜，茎用莴苣也称莴笋；我国是莴苣的主要生产国之一，叶用莴苣和茎用莴苣在我国各地广泛种植，产量和栽培面积均占到全球一半以上，居世界首位(张磊 2018；凌晨等 2022)。甘肃和青海的部分高海拔地区，气候冷凉湿润，特别适合莴苣的生长，近年来已形成了一批规模化莴苣生产基地(张爱丽 2017；俞连香和陈天泰 2018)，随着生产的规模化，莴苣连作及病害问题也日渐突出(白滨等 2019)。

嗜导管腐霉Pythium tracheiphilum Matta是莴苣作物的重要病原菌，1965年首次在意大利发现该菌，引起莴苣植株矮化、枯萎以及茎和根的维管束变黑(Matta 1965)，之后在荷兰、德国和美国的莴苣上陆续发现该菌(van der Plaats- Niterink 1981)。截至目前，嗜导管腐霉对莴苣的为害已扩大蔓延至西班牙、英国、澳大利亚、加拿大和阿根廷等国(Kiehr et al. 2015；Sauvageau et al. 2019；Farr & Rossman 2022)。嗜导管腐霉为害莴苣引起的症状包括矮化、枯萎、根腐、茎腐和叶疫等(Matta 1965；Kumar et al. 2007；Kiehr et al. 2015)，在加拿大的魁北克，嗜导管腐霉为害结球生菜(Head lettuce)造成的产量损失可达50% (Sauvageau et al. 2019)。

除莴苣外，嗜导管腐霉还可为害其他菊科和非菊科作物。在西班牙，嗜导管腐霉是菊苣Cichorium endivia维管束坏死的病原菌(Berbegal et al. 2012)；在丹麦，嗜导管腐霉引起白菜Brassica rapa var. glabra (Synonym：B. campestris ssp. pekinensis)叶腐和头腐病，损失高达40%- 50% (Møller & Hockenhull 1997)；在澳大利亚，嗜导管腐霉是伞形花科植物欧防风Pastinaca sativa根腐病的主要病原之一(Petkowski et al. 2013)。

2021年3月，在甘肃兰州的市售生菜上发现了叶疫病病株；同年6月，在连续多日的降雨之后(6月10-24日的15 d内，降雨日数多达12 d)，青海省海南藏族自治州贵德县新街乡种植的200 hm2莴笋，有1/3的田块发生严重的茎腐病，病田病株率达20%-30%，部分田块毁种。从生菜叶疫病和莴笋茎腐病样本上均分离到了产生球形孢子囊的腐霉菌，本研究对分离的腐霉菌株进行了致病性测定及形态学和分子生物学鉴定，以期为病害发生规律、种质资源抗性鉴定及病害防控研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病害标样

生菜叶疫病：1株，2021年3月28日，市售，产地兰州。莴笋茎腐病：2株，2021年6月28日，采自青海省贵德县新街乡，由圣博鑫农资兰州安宁经营部送检。

1.1.2 主要试剂和仪器

通用型基因组DNA小量提取试剂盒(TaKaRa Mini BEST Universal Genomic DNA Extraction Kit，Code No. 9765)，TaKaRa PCR扩增试剂盒Premix Taq™ (Code No. RR003A)，宝生物工程(大连)有限公司；梯度PCR扩增仪(PCR System 9700)，ABI公司。

1.1.3 培养基和配方

CMA：玉米粉20 g，琼脂粉12 g，蒸馏水1 000 mL (Atlas & Snyder 2006)。CMB：玉米粉20 g，蒸馏水1 000 mL。PCA：马铃薯20 g，胡萝卜20 g，琼脂粉12 g，蒸馏水1 000 mL (van der Plaats-Niterink 1981)。PDA：39 g PDA营养粉(DifcoTM，BD)，蒸馏水1 000 mL。

1.2 病原菌分离

以病株为单位进行病原分离，切取大小约5 mm×5 mm的病组织，75%乙醇表面消毒5 s，灭菌水冲洗4次，无菌滤纸吸干表面水分后置PDA平板上20 ℃黑暗培养，及时挑取菌落尖端菌丝进行纯化。纯化后的菌株接种于PDA斜面10 ℃保存。

1.3 致病性测定

1.3.1 离体叶片接种

自田间剪取莴苣(生菜) L. sativa、莴笋L. sativa var. angustata、华蒲公英Taraxacum sinicum、刺儿菜Cirsium setosum、青菜Brassica rapa var. chinensis、蚕豆Vicia faba、车前Plantago asiatica、马齿苋Portulaca oleracea和反枝苋Amaranthus retroflexus健康叶片，自来水冲洗干净后，置直径18.5 cm培养皿内的湿滤纸上或52 cm×32 cm×11 cm塑料保湿筐中备用；将测试菌株接种于PDA平板中央，25 ℃培养2 d，用无菌打孔器打取直径5 mm的菌饼，接种于离体叶片，依叶片大小，每枚叶片接1-3块菌饼，以接种直径5 mm的无菌PDA培养基块为对照，每处理10-19枚叶片，室温(20-25 ℃)及自然散射光下保湿培养。

1.3.2 植株接种

莴笋(50 d苗龄)、青菜(25 d苗龄)健康植株移栽至盛有无菌营养土的盆钵内，缓苗1周后接种；测试菌株在PDA平板25 ℃培养2 d，用无菌打孔器打取直径5 mm的菌饼，接种于莴笋茎(每株接种1枚菌饼)及青菜叶片上(每株接种4枚菌饼：3枚分别接种于3个叶片上，1枚接种于叶柄)，以接种直径5 mm的无菌PDA培养基块为对照，每处理10-12株，20-25 ℃及自然散射光下保湿培养。

随时观察各处理发病情况，并对发病叶片(接种后2 d)、茎(接种后6 d)进行病原菌的重新分离(每处理取2个发病叶片、茎，切取大小约5 mm×5 mm的病组织，75%乙醇表面消毒5 s，灭菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分后置PDA平板上25 ℃黑暗培养)。

1.4 病原菌生长温度测定及形态观察

试验菌株在PDA平板上25 ℃黑暗培养2 d后，用无菌打孔器自菌落边缘打取直径5 mm菌饼：接种于PDA平板中央，置于5、10、15、20、25、30和35 ℃下恒温黑暗培养，重复3皿，培养48 h测量菌落直径；将菌饼置于载玻片上的无菌水滴中，分别在20-25 ℃和10-19 ℃保湿培养，每处理3个重复，逐日观察不同温度条件下孢子囊产生情况，并测量孢子囊和休止孢大小，每个目标数据的测量≥30个数值。

试验菌株在CMA、PCA和PDA平板上25 ℃黑暗培养，重复3皿：培养2 d，测量菌落直径；培养7 d，观察菌落形态；培养15 d，观察孢子囊、藏卵器及卵孢子的产生情况及形态，测量藏卵器及卵孢子大小，每个目标数据的测量≥30个数值。

依据病菌的生长温度、培养特征和显微形态特征进行种类鉴定。

1.5 病原菌分子系统学分析

1.5.1 DNA提取及测序

DNA提取：取在CMB中25 ℃培养7 d的试验菌株菌丝，采用通用型基因组DNA小量提取试剂盒提取总DNA。

目的基因PCR扩增及测序：反应体系25 μL：Premix Taq 12.5 μL，引物正向/反向(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板3 μL，dH2O 7.5 μL。引物序列及反应条件见表1。PCR产物送擎科生物科技有限公司进行回收及TA克隆测序。测序结果在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov数据库进行BLASTn分析，并提交GenBank获得接受号。

表1 本研究所用引物序列及PCR条件

Table 1 The primer sequences and PCR conditions in this research

目标基因
Target gene 引物名称及序列
Primer name and sequence PCR条件
PCR condition 参考文献
Reference rDNA-ITS ITS5: 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′
ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ 95 °C 3 min; 95 °C 30 s, 55 °C 1 min, 72 °C 1 min, 35 cycles; 72 °C 10 min White et al. 1990 rDNA-LSU NL1: 5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′
NL4: 5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′ 94 °C 5 min; 94 °C 1 min, 55 °C 1 min, 72 °C 1 min, 25 cycles; 72 °C 5 min O’Donnell 1993; Uzuhashi et al. 2009 cox 1 OomCox1-Levup: 5′-TCAWCWMGATGGCTTTTTTCAAC-3′
OomCox1-Levlo: 5′-CYTCHGGRTGWCCRAAAAACCAAA-3′ 94 °C 3 min; 94 °C 30 s, 52 °C 30 s, 72 °C 1 min, 35 cycles; 72 °C 10 min Robideau et al. 2011; Rahman et al. 2015 cox 2 FM66: 5′-TAGGATTTCAAGATCCTGC-3′
FM58: 5′-CCACAAATTTCACTACATTGA-3′ 95 °C 5 min; 94 °C 1 min, 52 °C 1 min, 72 °C 1 min, 40 cycles; 72 °C 7 min Martin 2000; Uzuhashi et al. 2010rDNA-ITS：细胞核核糖体DNA，内转录间隔区；rDNA-LSU：细胞核核糖体DNA，28S大亚基；cox 1：线粒体DNA，细胞色素氧化酶亚基1；cox 2：线粒体DNA，细胞色素氧化酶亚基2rDNA-ITS: Nuclear rDNA, internal transcribed spacer region; rDNA-LSU: Nuclear rDNA, 28S large subunit; cox 1: Mitochondrial DNA, cytochrome oxidase subunit 1; cox 2: Mitochondrial DNA, cytochrome oxidase subunit 2.

1.5.2 构建系统发育树

基于试验菌株的rDNA-ITS、rDNA-LSU和coxⅠ序列构建系统发育树：从GenBank核酸序列数据库中下载相关菌株的核糖体DNA内转录间隔区(rDNA-ITS)、核糖体DNA 28S大亚基(rDNA-LSU)、细胞色素氧化酶亚基1 (cox 1)和细胞色素氧化酶亚基2 (cox 2)基因序列(表2)，以隐地疫霉Phytophthora cryptogea Pethybr. & Laff.为外群，用ClustalX1.83软件对目的序列进行比对(Alignment)，比对后的序列用MEGA 7.0软件进行ITS+cox 1+LSU序列拼接，以ML法(maximum likelihood，最大似然法)构建系统发育树(Kumar et al. 2016)，1 000 次Bootstrap检验计算系统树中节点的置信度。

表2 从GenBank 中下载的Pythium tracheiphilum及相关种类的rDNA-ITS、LSU、cox 1和cox 2序列

Table 2 The sequences of DNA-ITS, LSU, cor l and cox 2 of Pythium tracheiphilum and related species downloaded from GenBank

2 结果与分析

2.1 病害症状

生菜叶片受害，形成近圆形暗褐色大斑(图1A，1B)；莴笋茎部受害，病部褐色软腐，自侵染点处缢缩，病株顶部枯萎、折倒(图1C-1F)。病株无腐臭味，病部亦无肉眼可见的霉层。

图1 莴苣叶疫病和茎腐病症状

A，B：叶疫病. C-F：茎腐病(D和E是同一病株)

Fig. 1 Symptoms of leaf blight and stem rot on lettuces.

A, B: Leaf blight. C-F: Stem rot (D and E are same plant).

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2.2 病原菌分离结果

共分离得到6株腐霉属卵菌(每个标样分得2株，即2株分离自生菜病叶，4株分离自莴笋病茎)，标样的腐霉分出率为100%。

2.3 致病性

2.3.1 离体叶片接种

接种后24 h内显症，不同种类植物的发病率及病斑颜色不同(图2，表3)，病菌可侵染菊科的生菜、莴笋、华蒲公英和刺儿菜，以及十字花科的青菜和豆科的蚕豆；不侵染车前科的车前、马齿苋科的马齿苋和苋科的反枝苋；对照未发病。发病叶片原接种菌的分出率为100%。在试验条件下，菌株LPy-C和LPy-D对青菜的致病性强于LPy-B。

图2 离体叶片接种发病症状

A-C：依次为莴笋叶片接种菌株LPy-B、LPy-C和LPy-D 60 h. D：生菜叶片接种菌株LPy-B 4 d. E：华蒲公英叶片接种菌株LPy-B 6 d. F：刺儿菜叶片接种菌株LPy-D 48 h. G-I：依次为青菜叶片接种菌株LPy-B 62 h、LPy-C 40 h和LPy-D 40 h. J-L：依次为蚕豆叶片接种菌株LPy-B、LPy-C和LPy-D 40 h. 试验期间的温度为20-25 ℃

Fig. 2 Symptoms caused by artificial inoculation with Pythium tracheiphilum isolates on detached leaves.

A-C: Lactuca sativa var. angustata in 60 h inoculated by isolate LPy-B, LPy-C and LPy-D, respectively. D: L. sativa in 4 d inoculated by isolate LPy-B. E: Taraxacum sinicum in 6 d inoculated by isolate LPy-B. F: Cirsium setosum in 48 h inoculated by isolate LPy-D. G-I: Brassica rapa var. chinensis inoculated by isolate LPy-B, LPy-C and LPy-D, respectively (G: In 62 h; H, I: In 40 h). J-L: Vicia faba in 40 h inoculated by isolate LPy-B, LPy-C and LPy-D, respectively. The temperature during test was 20-25 °C.

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表3 试验菌株对测试植物离体叶片的致病性

Table 3 Pathogenicity of three Pythium tracheiphilum isolates for tested plant detached leaves

2.3.2 植株接种

接种后，青菜24 h内显症，莴笋48 h内显症；接种后4 d，全部青菜病株折倒；接种后6 d，60%的莴笋病株折倒，折倒病株的侵染点处明显缢缩，对照未发病(图3，表4)。莴笋病茎原接种菌的分出率为100%。

图3 接种菌株LPy-D的植株发病症状

A-F：莴笋接种后5-6 d. A，B：接种后5 d，示被侵染茎、叶上大的扩展型褐色病斑；C-F：接种后6 d (C：对照植株；D：病茎折倒；E：侵染点处缢缩；F：病茎剖面). G-I：青菜接种后22-48 h (G：22 h；H：38 h；I：48 h). 试验期间的温度为20-25 ℃

Fig. 3 Symptoms caused by artificial inoculation with Pythium tracheiphilum isolate LPy-D on tested plants.

A-F: Lactuca sativa var. angustata, in 5-6 d after inoculation. A, B: 5 d, large, expanded brown lesions on infected stems and leaves; C-F: 6 d (C: Mock-inoculated plant; D: Collapsed disease stem; E: Constricted at the infection site; F: Sections of disease stem). G-I: Brassica rapa var. chinensis, in 22-48 h after inoculation (G: 22 h; H: 38 h; I: 48 h). Temperature during test: 20-25 °C.

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表4 菌株LPy-D对测试植株的致病性

Table 4 Pathogenicity of Pythium tracheiphilum isolate LPy-D on tested plants

植物种类
Plant species 调查时间
Survey time
(DPI) 接种植株数/位点数
Number of inoculated
plant/Site 侵染植株数/位点数
Number of infected
plant/Site 折倒植株数
Number of
collapsed plant 菊科
Asteraceae 莴笋
Lactuca sativa
var. angustata (C) 6 12/12
(在茎上On stem) 10/10 6 十字花科
Brassicaceae 青菜
Brassica rapa
var. chinensis (C) 4 10/40
(在叶片和叶柄上
On leaf and petiole) 10/40 10C：栽培植物；DPI：接种后天数. 试验期间的温度：20-25 ℃C: Cultivated plant; DPI: Days post inoculation. Temperature during test: 20-25 °C.

2.4 病原菌生长温度测定及形态特征观察

菌株LPy-B和LPy-C的适宜生长温度为25 ℃，菌株LPy-D的适宜生长温度为20-25 ℃，3个菌株的最高生长温度均低于30 ℃ (图4)；

图4 温度对试验菌株菌丝生长的影响(PDA黑暗培养48 h)

Fig. 4 Effects of temperature on mycelial growth of tested Pythium tracheiphilum isolates incubated for 48 h on PDA in the dark.

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试验菌株在不同培养基上的生长速度存在差异(图5)。

图5 不同培养基对试验菌株菌丝生长的影响(25 ℃黑暗培养48 h)

Fig. 5 Effects of media on mycelial growth of tested Pythium tracheiphilum isolates incubated for 48 h at 25 °C on different medium in the dark.

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所有试验菌株菌丝白色，埋生，在CMA和PCA平板25 ℃培养7 d，无明显菌落特征，在PDA平板25 ℃培养7 d，菌落呈明显或不甚明显的花瓣状(图6)；不同菌株的产孢特性不同，20-25 ℃更适宜于菌株LPy-B产生孢子囊，10-19 ℃更适宜于菌株LPy-D产生孢子囊，菌株LPy-C产生孢子囊的温度范围较宽(表5，表6)。

图6 试验菌株在CMA、PCA和PDA培养基上25 ℃黑暗培养7 d的菌落形态

A-D：菌株LPy-B. E-H：菌株LPy-C. I-L：菌株LPy-D. A，E，I：CMA培养基；B，F，J：PCA培养基. C，D，G，H，K，L：PDA培养基. 培养皿直径为90 mm

Fig. 6 Colony morphology of tested Pythium tracheiphilum isolates incubated for 7 d at 25 °C on CMA, PCA and PDA media in darkness.

A-D: Isolate LPy-B. E-H: Isolate LPy-C. I-L: Isolate LPy-D. A, E, I: CMA medium; B, F, J: PCA medium; C, D, G, H, K, L: PDA medium. Diameter of Petri dishes is 90 mm.

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表5 试验菌株在不同培养基上25 ℃培养15 d孢子囊和卵孢子的形成情况

Table 5 Sporangium and oogonium forming situations of tested Pythium tracheiphilum isolates incubated for 15 d at 25 °C on different medium

菌株
Isolate 培养基 Medium CMA PCA PDA LPy-B 孢子囊
Sporangia +++ +++ + 卵孢子
Oospores +++ ++ - LPy-C 孢子囊
Sporangia ++ - - 卵孢子
Oospores ++* ++* - LPy-D 孢子囊 Sporangia - - - 卵孢子 Oospores +++* +++* -+++表示丰富；++表示中等；+表示少量；-表示不产生；*表示大多数卵孢子滞育或败育+++ Indicate abundant; ++ Indicate moderate; + Indicate few; - Indicate not produced; * Indicate most of oospores are diapausing or abortive. 表6 试验菌株在玻片水滴中保湿培养4 d的菌丝块(PDA)上产生的孢子囊的大小

Table 6 Sporangium sizes of tested Pythium tracheiphilum isolates grown on mycelial pieces (PDA) incubated for 4 d in water drops on slide

培养温度
Incubated
temperature (°C) 孢子囊形状
Sporangium shape 孢子囊大小
Sporangium sizes (μm) LPy-B LPy-C LPy-D 20-25 球形
Globose 17.13-38.10
(28.15±4.03) 23.88-53.73
(37.27±8.31) - 近球形至葫芦状
Subglobose to
gourd-shaped 24.58-40.97×18.62-32.77
[(33.23±5.40)×(25.78±4.03)] 29.85-56.72×28.36-53.73
[(47.96±8.63)×(39.90±8.64)] 10-19 球形
Globose - 20.90-32.84
(26.89±3.09) 17.91-35.82
(28.83±3.40) 近球形至葫芦状
Subglobose to
gourd-shaped 29.85-38.81×23.88-29.85
[(33.58±2.76)×(26.31±2.51)] 25.37-32.84×22.39-29.85
[(29.02±2.37)×(26.04±2.70)]-表示不形成或产生极少数量的孢子囊. 孢子囊大小以范围表示，括号中为平均数±标准差- Indicate sporangia are unformed or few. Sizes are expressed as scope of length and width limits with the mean±standard deviation inside brackets.

孢子囊顶生、间生或侧生，球形，17.13-53.73 μm，或近球形至葫芦状，24.58-56.72×18.62-53.73 μm；休止孢球形，6.70-9.68 μm；藏卵器光滑，顶生或间生，球形，15.64-23.09 μm；每个藏卵器有雄器1-2个，雄器与藏卵器同丝或异丝生；卵孢子满器或近满器，球形，直径13.41-20.11 µm，卵孢子壁厚0.74-2.23 µm (表6，图7，图8)。

图7 试验菌株菌丝块在玻片水滴中保湿培养产生的孢子囊、泡囊和休止孢的显微形态特征(20-25 ℃培养2-4 d)

A，B：菌株LPy-C. C-P：菌株LPy-B. A-H：孢子囊，培养2 d；I-P：孢子囊、泡囊和休止孢，培养4 d. 标尺：A-D=50 μm；E-P=20 μm

Fig. 7 Microscopic features of sporangia, vesicle and encysted zoospores of Pythium tracheiphilum, when mycelial pieces incubated for 2-4 d in water drops at 20-25 °C on slide.

A, B: Isolate LPy-C. C-P: Isolate LPy-B. A-H: Sporangia, incubated for 2 d; I-P: Sporangia, vesicle and encysted zoospores, incubated for 4 d. Scale bars: A-D=50 μm; E-P=20 μm.

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图8 雄器、藏卵器和卵孢子的显微形态特征(在PCA和CMA上25 ℃培养15 d)

A-E：菌株LPy-D，PCA培养基. F-P：菌株LPy-B，CMA培养基. A-J：发育中的雄器和藏卵器；K-P：成熟的卵孢子. 标尺=20 μm

Fig. 8 Microscopic features of antheridia, oogonia and oospores of Pythium tracheiphilum incubated for 15 d at 25 °C on PCA and CMA.

A-E: Isolate LPy-D on PCA medium. F-P: Isolate LPy-B on CMA medium. A-J: Developing antheridia and oogonia; K-P: Matured oospores. Scale bars=20 μm.

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通过与Pythium tracheiphilum Matta及相近种进行生长温度及形态特征比对(Matta 1965；Blok & van der Plaats-Niterink 1978；van der Plaats-Niterink 1981)，将菌株LPy-B、LPy-C和LPy-D鉴定为嗜导管腐霉P. tracheiphilum。

2.5 分子系统学分析

BLASTn分析结果显示，菌株LPy-B、LPy-C和LPy-D与GenBank中嗜导管腐霉模式菌株(CBS 323.65)的rDNA-ITS序列(HQ643862.1)、rDNA-LSU序列(HQ665207.1)和cox 2序列(KJ595375.1)的相似性分别为99.53%-99.76%、99.62%和99.78%；与GenBank中嗜导管腐霉菌株(BR 931)的cox 1序列(HQ708902.1)的相似性达100.00%。相似性比对结果与形态学鉴定结果一致。试验菌株所测基因序列的GenBank接受号见表7。在ITS+cox 1+LSU基因联合系统发育树中，菌株LPy-B、LPy-C和LPy-D与嗜导管腐霉菌株聚在一起，甘肃菌株(LPy-B)和青海菌株(LPy-C和LPy-D)被聚在嗜导管腐霉的不同亚群里(图9)。

表7 本研究试验菌株基础信息及所测基因序列的GenBank登录号

Table 7 Origin and GenBank accession numbers of the sequences for three Pythium tracheiphilum isolates used in this study

菌株
Isolate 本源信息
Origin 寄主
Host 来源
Source ITS LSU cox 1 cox 2 LPy-B 甘肃兰州
Lanzhou, Gansu, China,
2021-03-28 莴苣
Lactuca sativa 叶片
Leaf ON385135 ON385140 ON393917 ON393920 LPy-C 青海贵德
Guide, Qinghai, China,
2021-06-28 莴笋
L. sativa var. angustata 茎
Stem ON385136 ON385141 ON393918 ON393921 LPy-D 青海贵德
Guide, Qinghai, China,
2021-06-28 莴笋
L. sativa var. angustata 茎
Stem ON385137 ON385142 ON393919 ON393922

图9 基于rDNA-ITS、cox 1和LSU基因序列以最大似然法构建的系统发育树

分支上的数据表示Bootstrap检验的支持百分率，自展支持值(Bootstrap)>50%时显示在各个进化分支节点上；以隐地疫霉为此树的外群；模式菌株在培养物编号后标注以星号；本研究中的试验菌株以粗体突出显示；图中标尺表示每个位点的预期碱基替代数量

Fig. 9 Phylogenetic trees based on combined rDNA-ITS, cox 1 and LSU gene sequences using ML method.

The confidence values over 50% from 1 000 replicate bootstrap samplings are shown at each node. Phytophthora cryptogea is used as the outgroup. Type strains are marked with an asterisk after the culture number. Isolates reported in this research are highlighted in bold. The scale bar shows the expected number of changes per site.

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3 讨论

经致病性测定、形态学和分子生物学鉴定，确认嗜导管腐霉是引起甘肃省生菜叶疫病和青海省莴笋茎腐病的病原菌。嗜导管腐霉及其引起的莴苣叶疫和茎腐病在我国及亚洲地区系首次报道。

试验菌株在菌丝适宜生长温度、孢子囊产生温度和致病性等方面均存在差异；培养中未观察到典型的厚垣孢子(观察到的一些类似厚垣孢子的结构，更像是厚垣化的孢子囊)。在ITS+cox 1+LSU基因联合系统发育树中，甘肃菌株(LPy-B)和青海菌株(LPy-C和LPy-D)被聚在不同亚群里。受病害样本量的限制，试验菌株表现出的差异是地域间的差异还是寄主植物间的差异，还有待于在扩大样本量和试验菌株的基础上展开进一步的研究。

Blok & van der Plaats-Niterink (1978) 的人工接种试验表明，除莴苣外，嗜导管腐霉对黄瓜Cucumis sativus和花椰菜B. oleracea var. botrytis也具有强致病性，对番茄Lycopersicon esculentum和豌豆Pisum sativum的致病性稍弱，轻微侵染菊苣C. endivia、萝卜Raphanus sativus和亚麻Linum usitatissimum，不侵染小麦Triticum aestivum (Syn.：Triticum vulgare)、韭葱Allium porrum和胡萝卜Daucus carota。本研究结果显示，除莴苣外，嗜导管腐霉还可侵染华蒲公英、刺儿菜、青菜和蚕豆，不侵染车前、马齿苋和反枝苋。

嗜导管腐霉是土传病菌，很难通过短期的轮作来控制病害，Møller et al. (2003)在1995年和1999年开展的田间试验结果显示，粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea (Link) Schroers, Samuels, Seifert & W. Gams对嗜导管腐霉引起的大白菜叶腐病和头腐病具有较好的防控作用和增产效果。需要注意的是，尽管粉红螺旋聚孢霉对多种植物病原真菌、线虫和害虫具有很强的生物防治能力(Sun et al. 2020)，但同时也被报道是多种作物根病的病原菌(Bienapfl et al. 2012；Afshari & Hemmati 2017；Lee et al. 2020)。Tortolero & Sequeira (1978)的研究结果显示，不同地理来源的嗜导管腐霉菌株，致病性和致病类型存在差异，不同的莴苣品种表现出明显的抗性差异，种植抗病品种是经济可行的病害防控措施。截至2021年，我国已收集莴苣种质资源超4 000份，我国育种家选育的莴苣优良品种超过200个(凌晨等 2022)，为莴苣抗病品种的筛选提供保障。

尚未见到莴苣种子携带和传播嗜导管腐霉菌的报道，甘肃和青海的嗜导管腐霉极有可能为土著菌，集约化生产和感病寄主植物的重茬连作导致病菌数量累积，再加上适宜的气象条件造成了病害的暴发流行。鉴于嗜导管腐霉造成的巨大损失及潜在危害，在尽快查明嗜导管腐霉及其所致病害在我国的发生和分布情况的基础上，应加快、加强对我国丰富的莴苣种质资源的筛选和鉴定工作，充分利用种质资源的抗性，优化品种布局，降低病害损失。

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