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大把子杯桩菇：产自山西的一个新物种

花匠小妙招
2024-12-23 22:41

大把子蘑菇是山西吕梁山北部管涔山一带林区出产的一种野生食用蘑菇的俗称,因其菌柄极为粗壮而得名,也称大把子蘑菇或大把子银盘,因每年立秋后出现,故也有人称之为秋愣子或秋银盘。在管涔山地区,大把子蘑菇主要生长在华北落叶松Larix principis-rupprechtii Mayr和华北云杉Picea wilsonii Mast.纯林或两者混交林下的草地上,常常在绿草丛中形成很大的蘑菇圈。大把子蘑菇在多数年份里产量都较大,其菇体肥厚、形态独特、香气浓郁、味道上佳,是该地区很受欢迎的一种野生食用菌。2017年和2018年秋季行情,当地民众兜售该蘑菇的鲜品价格约每公斤40元左右,干品价格每公斤400-500元。大把子蘑菇是山西吕梁山北部管涔山民众数百年来采食的主要野生菌之一,是当地最有代表性的特产之一,也是当地山民每年秋季重要收入来源之一。然而,在山西省相关专业真菌分类学文献中,作者并没有发现这种蘑菇的科学名称（刘波 1991;卯晓岚 2000;李玉等 2015）。对已有中国相关文献（邓叔群 1963;戴芳澜 1979;应建浙 1982;张光亚 1984;毕志树和郑国杨 1987;刘波 1991;李建宗 1993;戴贤才 1994;应建浙 1994;卯晓岚 2000;戴玉成等 2010;李玉等 2015）进行分析查阅,也没有发现类似种的记载。

为了弄清大把子蘑菇的科学名称,以便为进一步深入研究和开发利用该种资源奠定科学基础,我们在山西吕梁山林区对该物种进行了样本的采集,采用DNA序列和形态学特征比较相结合的方法对其进行研究,结果显示管涔山大把子蘑菇是一个尚未描述的新物种。

1 材料与方法

1.1 标本采集

本研究依据的担子果标本分别于2017年和2018年秋季采自中国山西省中北部管涔山、中部关帝山、南部五鹿山一带的华北落叶松Larix principis-rupprechtii、华北云杉Picea wilsonii、油松Pinus tabuliformis以及栎Quercus spp.树林中草地上。新鲜的担子果标本经45℃烘干后保存于首都师范大学标本馆（BJTC）和山西省农业科学院食用菌研究所标本馆（HSA）。

1.2 形态学方法

在手持放大镜和体视显微镜下,对担子果的宏观形态学特征进行观察和描述,包括担子果的形状、大小、颜色、菌褶及菌柄特征等。在光学显微镜下,对担子果的显微结构特征进行观察。采用手术刀对菌盖表皮、菌褶、菌柄表皮等组织进行徒手切片,以蒸馏水、3% KOH作为浮载剂,分别采用棉兰（cotton blue）和梅氏试剂检测（Melzer’s reagent）担孢子壁有无嗜蓝和淀粉质反应。就担孢子大小而言,每份标本测量30个孢子,统计测量数值,Q表示担孢子的长宽比。

1.3 DNA序列测定和系统发育树构建

新增标本的DNA提取、PCR以及序列测定参照Fan et al.（2016）和Huang et al.（2017）的方法进行。采用CTAB法（Gardes & Brun 1993）提取担子果干标本总DNA后,扩增核糖体DNA内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）片段,PCR扩增引物为ITS1-F/ITS4（Gardes & Brun 1993）,扩增条件为：94℃预变性3min,94℃变性30s,53℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环,最后72℃延伸10min;扩增核糖体大亚基（nuclear large subunit rDNA,28S nrDNA）序列,PCR扩增引物为LROR/LR5（White et al. 1990）,扩增条件为95℃预变性4min,94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,35个循环,最后72℃延伸10min;扩增核糖体小亚基（nuclear small subunit rDNA,18S nrDNA）序列,PCR扩增引物为PNS1/NS8（White et al. 1990;Hibbett 1996;Rehner & Buckley 2005）,扩增条件为94℃预变性3min,94℃变性1min,55℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环,最后72℃延伸10min;扩增延伸因子tef1（translation elongation factor 1α,tef1）序列,PCR扩增引物为EF1-983F/EF1-1567R（Rehner & Buckley 2005）,扩增条件为95℃预变性10min,94℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环,最后72℃延伸10min;扩增RNA聚合酶II第二大亚基（second-largest subunit of RNA polymerase II,rpb2）序列,PCR扩增引物为b6f/b7.1R9（Matheny 2005）,扩增条件为95℃预变性3min,95℃变性1min,55℃退火2min,72℃延伸2min,30个循环,最后72℃延伸10min。PCR产物经纯化和测序（北京中科希林生工生物技术有限责任公司）获得的序列经手工校对后,于GenBank进行比对和注册序列号（表1）。

系统发育树的构建和分析参照Fan et al.（2016）和Huang et al.（2017）的方法进行。将供试标本序列于GenBank中进行Blast比对,并采用Alvarado et al.（2018）最近相关研究所使用的序列合并为数据集（表1）。采用ITS序列数据集和28S nrDNA-18S nrDNA-tef1-rpb2 4基因联合数据集分析大把子蘑菇样本的系统学地位。序列数据集的构建方法为：1）采用Clustal X（Thompson et al. 1997）软件对各基因的序列进行比对;2）采用Gblocks在线软件（http://molevol.cmima.csic. es/castresana/Gblocks_server.html）筛选各基因序列的保守区域;3）4基因联合数据集按照28S nrDNA-18S nrDNA-tef1-rpb2的顺序将筛选后的保守序列矩阵拼接后构成。建树最优模型采用MrModeltest v2.3（Nylander 2004）软件进行。以最大似然法（Maximum Likelihood,ML）采用RAxML 8.0.14软件构建ML树,以最大简约法（Maximum Parsimony,MP）采用PAUP* 4.0b10.（Swofford 2002软件构建MP树,自举检验1 000次,分析检验各节点的置信度。对于ITS数据集以Pseudoclitocybe cyathiformis (Bull.) Singer为外群,对于28S nrDNA-18S nrDNA-tef1-rpb2 4基因联合数据集以P. cyathiformis和P. obbata (Fr.) Singer为外群,两者建树用最优模型均为“GTR+GAMMA+I”。采用TreeView32(Page 2001)查看树的拓扑结构,支持值大于70（MLBS≥70%,MPBS≥70%）视为可靠的支持值。

2 结果与分析

2.1 系统发育分析

本研究用于进行分子系统学分析的基因片段和相关序列信息见表1。因最大似然法和最大简约法分析得出的系统发育树的拓扑结构相似,本研究仅显示以最大似然法构建的系统发育树（图1和图2）。基于4个基因片段（28S nrDNA、18S nrDNA、tef1和rpb2）构建的系统发育树（图1）显示,山西大把子蘑菇（BJTC FM358）的序列与杯桩菇属Clitopaxillus物种的序列聚为一支,具有很高的自举值（MLBS=100%,MPBS=100%）,支持山西的大把子蘑菇归属于杯桩菇属;基于nrDNA-ITS序列构建的单基因系统发育树（图2）显示,来自山西大把子蘑菇的6条序列聚为一枝并获得很高的支持（MLBS=99%,MPBS=100%）,本属另外2个欧洲物种分支也具有较高的自举值,分别代表C. alexandri（MLBS=100%,MPBS=100%）和C. fibulatus（MPBS=71%）,该结果支持山西的大把子蘑菇为独立物种。

图1 基于28S nrDNA、18S nrDNA、tef1和rpb2的大把子杯桩菇及其相关物种的ML树

本研究获得的序列以阴影表示

Fig. 1 Phylogenetic tree derived from maximum likelihood analysis (ML) based on 28S nrDNA, 18S nrDNA, tef1, rpb2 for Clitopaxillus dabazi. Likelihood and parsimony bootstrap support values (≥70%) are indicated above the nodes as MPBS/MLBS. The sequence obtained in this study is represented by shadows.

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表1 本研究所用样品的名称、凭证标本和序列登录号

Table 1 Scientific name, sampling locality and sequence information of samples used in this study

物种
Taxon 凭证
Voucher 产地
Origin GenBank收录号
GenBank accession numbers ITS 28S nrDNA 18S nrDNA tef1 rpb2 Clitocybe cf. alexandri MCVE 5953 Italy JF907816 - - - - Clitopaxillus alexandri AH 39034 Spain MG321334 - - - - C. alexandri AH 39054 Spain MG321335 - - - - C. alexandri AH 39068 Spain MG321336 - - - - C. alexandri AMB 18219 Italy MG321337 - - - - C. alexandri AMB 18220 Italy MG321338 - - - - C. alexandri AMB 18221 Italy MG321339 MG321392 - MG334536 - C. alexandri LIP 0401379 France MG321340 - - - - C. alexandri LIP 0401301 France MG321341 - - - - C. alexandri LIP RC/F91.232 France MG321342 - - - - C. alexandri MCVE 25090 Italy MG321343 - - - - C. alexandri O-175145 Norway MG321344 - - - - C. alexandri TO AV45634 Italy MG321345 MG321393 MG321329 MG334537 MG334546 C. dabazi BJTC FM085 China MN334167 MN923176 MN923182 - MN923172 C. dabazi BJTC FM117 China MN334162 MN923177 MN923183 - - C. dabazi BJTC FM118 China MN334163 MN923178 MN923184 - MN923173 C. dabazi BJTC FM119 China MN334164 MN923179 MN923185 - - C. dabazi BJTC FM358 China MN334165 MN923180 MN923186 MN923171 MN923174 C. dabazi BJTC FM403 China MN334166 MN923181 MN923187 - MN923175 C. fibulatus AMB 18222 Italy MG321346 - - - - C. fibulatus AMB 18223 Italy MG321347 - - - - C. fibulatus AMB 18224 (type) Italy MG321348 - - - - C. fibulatus DB 6191 Norway MG321349 - - - - C. fibulatus LIP 0401380 France MG321350 - - - - C. fibulatus LIP 0401381 France MG321351 - - - - C. fibulatus O-74584 Norway MG321352 - - - - C. fibulatus O-82069 Norway MG321353 - - - - C. fibulatus O-82070 Norway MG321354 - - - - C. fibulatus TO AV190916 Italy MG321355 MG321394 MG321330 - MG334547 C. fibulatus TUR-A-140440 Finland MG321356 - - - - Harmajaea guldeniae O-64624 Norway MG321362 MG321397 MG321332 MG334539 - H. guldeniae TUR 201099 Finland MG321398 - MG334540 - H. harperi LIP 0401361 USA MG321366 MG321399 MG321333 MG334541 MG334549 H. harperi TUR 173042 Finland MG321367 MG321400 - - - H. wellsiae TUR 205933 Finland MG321370 MG321401 - MG334542 MG334550 Musumecia alpina Tang-1778 China KR909099 KR909102 - KR909096 - M. alpina Yang-090 China KR909098 KR909101 - KR909095 - M. bettlachensis TO HG2284 France JF926520 JF926521 KJ681069 KJ681082 KJ681060 M. vermicularis LUG18975 France KF941322 KJ681037 KJ681070 KJ681083 KJ681061 Pogonoloma macrorhizum TENN:037026 Austria KP453700 KJ417209 KJ417168 - - P. spinulosum K(M):107286 UK KP453705 KJ417238 KU058571 - KJ424401 Pseudoclitocybe cyathiformis AFTOL ID-1998 USA GU187553 EF551313 GU187659 GU187742 GU187815 P. cyathiformis HE21055 China KC505562 - - - - P. cyathiformis TO HG2285 Italy JF926522 - - - - P. obbata AMB 18231 Italy MG321388 MG321403 - MG334545 MG334551 Note: The sequences obtained in this paper are shown in bold.注：本研究获得的序列以粗体表示

图2 基于nrDNA-ITS基因片段的大把子杯桩菇及其相关物种的MP树

相关序列以阴影表示

Fig. 2 Phylogenetic tree based on nrDNA-ITS for Clitopaxillus dabazi. Likelihood and parsimony bootstrap support values (≥70%) are indicated above the nodes as MPBS/MLBS (left to right).

The related sequence are represented by shadows.

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2.2 分类学

大把子杯桩菇新种图3

Clitopaxillus dabazi L. Fan & H. Liu, sp. nov. Fig. 3

Fungal Names FN570697

Etymology: dabazi, local name for this species, meaning “big stipe”, referring to robust stipe of the basidiocarp.

Pileus convex with margin enrolled when young, then expanded or slightly depressed with age, brownish grey, pale earth-brown, ochraceous grey or buff, 3-25cm in diam., surface even and glabrous. Lamellae adnate to decurrent, whitish, cream to yellowish buff, crowded. Stipe 4-15× 1-4cm, solid and soft, typically clavate to ampuliform when young, then gradually cylindrical with age, concolorous with pileus surface or paler, usually covered with whitish fibrils. Context whitish, firm when young, slightly spongy at maturity; smell light, taste not acrid, not bitter. Spores 5.2-7.0× 3.0-4.5μm (n=30), Q=1.30-1.59, ellipsoid, hyaline, usually with one large guttula, very slightly amyloid, poorly cyanophilous, smooth. Basidia 17.5-32.5× 5.0-7.5μm, 4-spored, clavate, sterigmata usually less than 2.5μm long. Hymenophoral trama composed of hyphae 5.0-12.5μm in diam., hyaline, thin-walled. Cheilocystidia 32.5-40.0×7.0-8.5μm, lageniform to long clavate, scattered. Pleurocystidia rare and similar to cheilocystidia. Pileipellis composed of subparallel to interwoven hyphae, 2.5-7.5μm in diam., hyaline to slightly yellowish. Pileitrama hyphae 5.0-12.5μm in diam., hyaline. Clamp connections present, frequent but not on every septum.

Typification: China. Shanxi Province: Dashidong, Mt. Guancen, on grass glade under plants of Picea sp., 23 Aug. 2017, Jinzhong Cao, CAO010 (BJTC FM085, holotype).

Specimens examined: China. Shanxi Province: Mt. Guancen, on grass glade under plants of Picea sp. and Larix sp., Alt. 2 100m, 24 Aug. 2017, Ting Li, LT170821 (BJTC FM117); ibid, LT170822 (BJTC FM118); ibid, LT170823 (BJTC FM119); From Market of Ningwu county, 14 Aug. 2017, Hong Liu, CAO1690 (BJTC FM403);Mt. Guancen, on grass glade under plants of Larix sp., 4 Sept. 2018, Jinzhong Cao, LH344 (HSA344); Mt. Wulu, on ground under plants of Pinus sp. and Quercus sp., 12 Sept. 2017, Ting Li, LT170880 (BJTC FM358); Mt. Guandi, Alt. 2 200m. on ground under plants of Picea sp., 6 Sept. 2018, Jinzhong Cao, LH405 (HSA405).

Habitat and distribution: Autumn, scattered, gregarious or often in fairy ring on grass glade under forests dominated by Picea sp. and Larix sp., also under Pinus tabuliformis or Quercus spp.

担子果中型至大形,菌盖初期半球形至扁半球形,边缘内卷,后直径渐渐增大并平展,老熟后或多或少上翻,中部平或稍下凹,光滑,无毛,边缘整齐,无条纹,干燥,灰白色、浅灰褐色或土黄褐色,5-25cm;菌褶灰白色、灰浅土褐色,不等长,较密,直生;菌柄4-15cm,粗1-4cm,幼时基部明显膨大呈棒状或瓶状,后上部渐渐变粗,成熟后棒状或圆柱状,与菌盖同色或灰白色,中实但稍疏松,表面平滑或有不明显的纤毛状鳞片,近基部常水渍状。菌肉污白色,气味清淡,味道不苦、不辣;担孢子椭圆形,5.2-7.0×3.0-4.5μm （n=30）,Q=1.30-1.59,无色,表面光滑,通常含有一个中央大油滴,弱淀粉质,弱嗜蓝反应。担子棒状,17.5-32.5×5.0-7.5μm,4孢子,小梗通常短于2.5μm。子层体菌髓组织菌丝无色,薄壁,直径5.0-12.5μm。褶缘囊状体烧瓶状至棒状,32.5-40.0× 7.0-8.5μm,散生在菌褶边缘。侧生囊状体少见,与缘囊体相似。菌盖皮层由近平行或交织的菌丝组成,菌丝直径2.5-7.5μm,无色或浅黄褐色。菌盖菌髓组织菌丝无色,直径5.0-12.5μm,薄壁。锁状联合存在,出现在多数菌丝横隔上。

生境和分布：单生或群生,见于云杉和落叶松为建群种的林下草地上,常形成蘑菇圈,秋季产生。分布于山西吕梁山脉北部、中部及南部地区。

标本：中国：山西,管涔山大石洞,云杉林内草地上,2017年8月23日,曹晋忠,CAO010（BJTC FM085,主模式）;山西,管涔山南沟庙,海拔2 100m,云杉-落叶松混交林内草地上,2017年8月24日,李婷LT170821（BJTC FM117）、李婷LT170822（BJTC FM118）、李婷LT170823（BJTC FM119）;山西,宁武县市场购买,2017年8月14日,刘虹CAO1690（BJTC FM403）;山西,管涔山秋千沟,落叶松林内草地上,2018年9月4日,曹晋忠LH344（HSA344）;山西,五鹿山,油松-栎混交林内地上,2017年9月12日,李婷LT170880（BJTC FM358）;山西,关帝山庞泉沟,海拔2 200m,云杉林内地上,2018年9月6日,曹晋忠LH405（HSA405）。

图3 大把子杯桩菇

A,B：担子果;C：担孢子;D：担子;E：褶缘囊状体;F：市场销售的大把子杯桩菇. 标尺：A,B,F=5cm;C-E=5μm

Fig. 3 Clitopaxillus dabazi.

A, B: Basidiocarps; C: Basidiospores; D: Basidia; E: Cheiocystidia; F: Clitopaxillus dabazi sold in the market. Bars: A, B, F=5cm; C-E=5μm.

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3 讨论

杯桩菇属Clitopaxillus已知2种,均产于欧洲（Alvarado et al. 2018）,本新种是该属第3个物种。多基因的系统发育分析（图1）显示,分布于山西省云杉-落叶松林下的蘑菇新物种大把子杯桩菇C. dabazi与欧洲的C. alexandri (Gillet) G. Moreno et al.[异名：Clitocybe alexandri (Gillet) Gillet]和C. fibulatus P.A. Moreau et al.有密切的亲缘关系（图1）。形态上,这3个物种均为菇体粗壮的大型蘑菇,形态特征较为相似。其中,C. alexandri与大把子杯桩菇的担子果颜色相近,主要区别在于前者担子果有苦杏仁味,菌盖中央凸起,菌柄圆柱形,锁状联合只出现于担子基部和亚子实层,没有囊状体,担孢子较小（4.7-5.5× 3.5-3.9μm）（Alvarado et al. 2018）;多基因分子系统学分析显示本新种与C. fibulatus是系统发育上的姊妹种（sister species）（图1）,但C. fibulatus的菌盖表面有一层微绒毛,菌盖偏黄褐色或带红黄褐色,菌盖边缘成熟时或多或少波浪状,菌柄圆柱状,下部有一层乳白色绒毛,基部有发育完好的白色菌丝束,担子果味道辛辣,锁状联合出现在菇体组织所有菌丝的横隔上（Alvarado et al. 2018）,而新种大把子杯桩菇菌盖表面光滑,颜色以灰白褐色为主调,整个菌柄表面没有绒毛,近基部常呈明显的水渍状,基部没有发育完好的菌丝束。生态学方面,新种大把子杯桩菇主要生长在云杉、落叶松林下的鲜活草丛中（living grasses）,呈蘑菇圈（fairy ring）状生长,而欧洲的C. alexandri 和C. fibulatus主要生长在多种针叶林下的枯枝落叶层上（litters）,散生或群生。此外,这3个物种现在已知样本的分布特点是：欧洲的C. fibulatus为北极-高山分布,栖息地气候为寒带-寒温带气候型,C. alexandri为地中海-大西洋（mediterraneo-atlantic）分布,栖息地气候为暖温带-亚热带气候型（Alvarado et al. 2018）,而中国的大把子杯桩菇C. dabazi为高山-亚高山分布,栖息地气候为寒温带-温带气候型。基于ITS片段的系统发育分析显示大把子杯桩菇的序列在系统发育树上聚为独立的分支并得到很高的自举值（图2）,支持大把子杯桩菇为一个独立的物种。此外,大把子杯桩菇与另外2个欧洲近缘物种（C. alexandri和C. fibulatus）的分布区存在明确的地理对应关系,符合地理隔离（geographic isolation）导致物种形成（speciation）的特征。

杯桩菇属Clitopaxillus是欧洲学者近期建立的一个新属,隶属于伞菌目Agaricales的假杯伞科Pseudoclitocybaceae,此前该属已知2种,均为欧洲本土种（Alvarado et al. 2018）,本新种是该属第3个物种,也是欧洲之外到目前为止唯一发现的该属物种。

值得一提的是,ITS片段在杯桩菇属属内高度保守。DNA序列分析显示我国大把子杯桩菇与欧洲的C. fibulatus ITS序列同源性为98%-99%,与本属另一个欧洲本土物种C. alexandri间的同源性为97%-98%,而两个欧洲本土物种C. alexandri和C. fibulatus之间的ITS同源性也高达98%。另一方面,依据我们得到的杯桩菇属所有ITS片段数据对全球已知的3个物种的种内同源性分析显示,其中两个欧洲种C. fibulatus和C. alexandri的种内ITS序列同源性分别高达100%,我国山西吕梁山脉分布的大把子杯桩菇的种内ITS序列同源性也高达99.8%-100%。

大把子杯桩菇是山西吕梁山脉林区最知名、也是产量最高的一个野生食用菌物种,但过去一直没有准确的分类鉴定。本研究发现大把子杯桩菇在吕梁山脉从北到南均有分布,除北部的管涔山地区外,中部的关帝山一带也有出产,生长环境和管涔山相同。此外,该物种在吕梁山南部的五鹿山海拔800-1 200m之间也有零星分布,生长在油松林或油松和栎树的混交林中。就栖息地而言,大把子杯桩菇在吕梁山北部的管涔山一代的生长环境与欧洲的C. fibulatus较为接近;而在南部的五鹿山地区,生长环境和欧洲的C. alexandri非常相似（Alvarado et al. 2018）。大把子杯桩菇的营养型尚不清楚,本文作者采用PDA或PDA+牛肉膏培养基尝试分离菌种,但目前尚未成功。

杯桩菇属Clitopaxillus分种检索表

1. 菌盖中央有凸起,担孢子长度多短于5μm·································C. alexandri

1. 菌盖表面平坦,中央无凸起,担孢子长度多长于6μm·································2

2. 担子果黄褐色或红褐色,菌盖表面和菌柄下部有绒毛·································C. fibulatus

2. 担子果灰褐色或灰白色,菌盖表面和菌柄光滑·································C. dabazi

致谢：曹晋忠博士对本文提供了有价值的建议,首都师范大学生命科学学院博士研究生李婷参加标本采集及部分实验工作,特此致谢。

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