一种嫁接介导的RNAi技术促进菊花提前开花的方法与流程
本发明属于植物栽培技术领域，涉及一种植物花期的调控方法，更具体而言，涉及一种通过嫁接介导的rnai技术促进菊花提前开花的方法。
背景技术：
菊花因秋天开花特性，生产上培育期比较长，一定程度上影响了菊花的应用。例如，大多数菊花品种花期在国庆节之后，就影响了其在国庆旅游旺季的应用。因而促进菊花提前开花，对于减少栽培成本具有特别重要的意义。
对菊花花期调控研究表明，通过短日照、甲基化抑制剂（5-azac、姜黄素、地西他滨等）处理等方法可使菊花的多个品种花期提前，其中短日照处理后初花时间可提前11~19天，而甲基化抑制剂可使花期提前7~10天。但总体而言，现有花期调控方法较为耗时耗力，且易受环境因素影响而发生逆转，不能稳定的遗传，因此每年都要进行处理，难以得到有效推广应用。
分子生物技术的发展，为菊花新品种培育提供了新方法、新途径，也使可提前开花菊花性状的稳定遗传具有了可能性。现有技术中，专利《一种利用rnai载体调节菊花开花时间的方法》（申请号：201710049401x）中，从分子水平入手，利用rnai技术干扰了dna甲基化基因的表达，使dna甲基化水平降低从而影响了开花时间，进而使得可提前开花性状能够得到稳定遗传。但是该专利技术在应用中也存在一定缺陷，主要是：rnai转基因植株可能会通过传粉途径与周围自然生长条件下的菊花发生天然杂交，进而存在着基因漂移的风险，此外该方法调控菊花花期，每调控一个品种，都必须要进行一次转基因过程，费时费力。
总之，开发新的花期调控方法及调控技术，对于花卉栽培技术发展及推广花卉应用具有十分重要的科研意义和应用意义，尚需进行进一步的深入研究。
技术实现要素：
本申请目的在于提供一种嫁接介导的rnai技术促进菊花提前开花的方法，该方法以现有的rnai干涉促进菊花提前开花技术为基础，结合嫁接技术应用，在保证转基因材料安全性的前提下，通过将不同菊花品种嫁接至转基因材料上，调控不同品种菊花的花期，促使菊花提前开花，为菊花栽培技术的发展提供新的技术思路和参考。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种嫁接介导的rnai技术促进菊花提前开花的方法，包括如下操作步骤：
（1）制备砧木，所述砧木为采用rnai技术沉默甲基化基因后的转基因菊花材料，具体例如为采用rnai技术沉默甲基转移酶met1基因后的菊花植株，具体操作例如《一种利用rnai载体调节菊花开花时间的方法》（申请号：201710049401x），即rnai干扰met1基因后的转基因“紫精灵”；
所述转基因材料，在生长至株高为20~25cm左右时，摘除顶端芽，打破顶端优势，使其生长侧枝；待其生长出2~3个侧枝后，摘除多余侧芽后即可备用作为砧木，以方便进一步进行嫁接处理，待侧枝长至10~15cm时即可作为砧木进行嫁接；
（2）选择接穗，选择生长健康、长势一致的目标品种的菊花幼枝，去除基部叶片与腋芽后作接穗；
所述菊花幼枝长度为4~5cm左右；
所述目标品种例如为：早花品种“国庆红”、晚花品种“洹水金秋”等；
（3）嫁接操作，将步骤（2）中接穗嫁接至步骤（1）中的砧木，具体例如采用劈接法进行操作，具体操作方法为：
将步骤（2）中接穗的基部削成长2~3厘米的平滑楔状；
割断步骤（1）中砧木主枝顶端，纵切砧木主枝中心使其形成长2~3厘米缝隙；
然后将削好的楔形接穗放入砧木间缝中，对齐贴紧；
用保鲜膜自下而上绑紧扎实；
嫁接完成后，正常田间管理即可。
嫁接方法是作物栽培育种中一种十分常用的方法，但在花期调控中的应用十分有限，而且由于菊花草本特性，应用相对较少。新的rnai沉默技术调控菊花花期的成果，使得菊花提前开花性状的稳定遗传有了实现的可能。在此基础上，利用嫁接技术，发明人以转基因菊花材料作为砧木，以非转基因菊花品种为接穗，而rnai沉默信号在嫁接部位进行传递，使其在接穗中发挥作用干扰接穗中met1基因的表达从而影响dna甲基化水平，进而影响接穗品种菊花的开花时间。
本申请中，由于转基因菊花材料仅作为砧木，不用于开花，因而可以较好避免基因漂移的生物安全风险，另外，通过嫁接技术的应用，只需一个转基因菊花品种材料即可实现不同菊花品种的提前开放，避免了每个品种的转基因操作，适用性较好。
总体而言，本申请所提供的促进菊花提前开放方法，在确保植株正常生长和菊花品质稳定的基础上较好实现了提前开花的目的，对于培育优良品种的早花系具有较好的应用价值；同时该方法相较于其他花期调控方法而已，人力、物力投入较少，适于批量化、规模化生产，生产效益较为客观，因而具有较好的推广应用价值。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分物料情况简要介绍如下。
生物材料：
转基因“紫精灵”菊花材料，具体参见《一种利用rnai载体调节菊花开花时间的方法》（申请号：201710049401x）中操作，由于该材料为发明人所制备，因而保留有相关材料；
早花品种“国庆红”、晚花品种“洹水金秋”，均为常见菊花品种。
实施例
本申请所提供的嫁接介导的rnai技术促进菊花提前开花的方法，具体操作过程简要介绍如下。
（1）制备砧木，以rnai干扰met1基因后的转基因“紫精灵”菊花材料为例，由于原始材料相对有限，因而首先进行适当扩增繁殖备用，扩增繁殖时采用组培方式进行，所用培养基为：ms+1.0mg/l6-ba+0.15mg/lnaa（ph=5.8），然后用ms培养基作为生根培养基进行生根，配方为ms+3%蔗糖。培养条件为：温度（25±1）℃，光照强度为2000lux，每天光照时间为12。
菊花幼苗生根后，继续培养1~2个月后进行常规炼苗，炼苗时，将生根幼苗移栽至穴盘中进行炼苗，穴盘中培养基质为：珍珠盐：草木炭=2：1（质量比）；自然环境中遮光培养；
待菊花幼苗长出新根后，移栽至试验田内，进行常规田间管理作为砧木备用；
以河南地区为例，转基因材料在大约6月初时，即可生长至20~25cm左右，此时摘除顶端芽，打破顶端优势，使其生长侧枝；待其生长出2~3个侧枝后，摘除多余侧芽后即可备用作为砧木，以方便进一步进行嫁接处理，待侧枝长至10~15cm时即可作为砧木进行嫁接。
（2）选择接穗，选择生长健康、长势一致的目标品种的菊花幼枝，去除基部叶片与腋芽后作接穗；
所述菊花幼枝长度为4~5cm；
所述目标品种具体以早花品种“国庆红”和晚花品种“洹水金秋”为例。
（3）嫁接操作，将步骤（2）中接穗嫁接至步骤（1）中的砧木，具体例如采用劈接法进行操作，具体操作方法为：
将步骤（2）中接穗的基部削成长2~3厘米的平滑楔状；
割断步骤（1）中砧木主枝顶端，纵切砧木主枝中心使其形成长2~3厘米缝隙；
然后将削好的楔形接穗放入砧木间缝中，对齐贴紧；
用保鲜膜自下而上绑紧扎实；
以河南地区为例，嫁接时间为七月中旬左右进行，嫁接操作时以下午16:00~18:00操作为宜；
菊花接穗品种洹水金秋分别嫁接到12株转基因和12株非转基因菊花品种紫精灵上，每株含有2~3个接穗；菊花接穗品种国庆红作同样处理；
嫁接完成后，正常田间管理即可。
嫁接完成后，记录试验过程中的现蕾日期（现蕾日期以出现肉眼可见的花苞为标准进行统计）、开花日期（开花日期以花瓣全部展开为标准进行统计）、现蕾时间（现蕾时间以现蕾日期-移栽日期为标准进行统计）、开花时间（开花时间以开花日期-移栽日期为标准进行统计）。
最终统计结果如下表所示：
注：对照组为嫁接到非转基因紫精灵上的菊花品种，处理组为嫁接到转基因紫精灵上的菊花品种。
从上述结果可以看出：接穗晚花品种“洹水金秋”对照组与处理组花蕾出现时间和初花时间分为121d和154d、109d和145d；而在嫁接于rna干涉转基因植株后，现蕾时间和开花时间与对照组相比都显著缩短，分别提前12d和9d，花蕾发育时间处理组与对照间没有差异；
接穗早花品种“国庆红”处理组与对照之间几乎同时现蕾，处理组显著性的缩短了花蕾发育时间，从而使菊花提前12d开花。
分析可以看出，以可以提前开花的转基因材料作为砧木，嫁接常规菊花品种后，针对不同菊花品种（早花品种、晚花品种）时，现蕾时间提前效果不太一致，但就开花时间而言，均能较好实现提前开放效果，证明了本技术的可行性，而利用该技术，对于调节菊花花期具有十分重要的应用意义。
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