首页 > 分享 > 早期真菌与本土和外来松的菌根合成

早期真菌与本土和外来松的菌根合成

花匠小妙招
2024-12-27 14:53

外生菌根菌(ectomycorrhizal fungi,EMF)是一类能与林木根系共生并形成外生菌根的真菌,许多EMF为野生食用菌,且对林木的生长有促进作用,具有重要的生态与经济价值(Murat et al. 2018;Tederso & Bahram 2019)。孢子、菌丝和菌根等是EMF维持与扩散的主要繁殖体,而孢子传播则是其最为重要的扩散形式,特别是对乳牛肝菌属Suillus、蜡蘑属Laccaria和须腹菌属Rhizopogon等早期EMF来说,这些类群也被认为在先锋树种(如松属Pinus)的定植、扩散与入侵中发挥着重要的作用(Bowen 1994;Vlk et al. 2020;Ning et al. 2021)。

菌根合成是开展EMF研究的基础,一方面,它是确定植物与EMF共生关系的有效方法,另一方面,它为可食用EMF的人工栽培提供可能(Guerin-Laguette 2021)。孢子和菌丝是菌根合成中最为常用的接种菌剂,其中后者需要先分离获取菌丝才能开展接种试验,其相较于孢子接种周期长、成本高,而且目前许多EMF的菌种分离与培养还十分困难,因此研发孢子接种在EMF菌根合成中的应用是外生菌根研究的重要方向。

松树是北半球温带森林的主要建群树种,也是我国重要的造林和用材树种,为此还从国外引进了湿地松Pinus elliottii、辐射松P. radiata等速生物种。许多EMF都能与松共生并形成外生菌根,除了乳牛肝菌、蜡蘑和须腹菌等先锋类群,也不乏具有较高经济价值的物种,如乳菇属松乳菇组的物种Lactarius spp. section Deliciosi、块菌Tuber spp.等(Wang 2012;Wang et al. 2019,2020;Wu et al. 2019;戴玉成等2021)。

褐环乳牛肝菌 Suillus luteus (L.) Roussel、虎皮乳牛肝菌S. phylopictus Rui Zhang et al.和酒红蜡蘑Laccaria vinaceoavellanea Hongo是我国西南市场上常见的野生食用菌,常见于松林或针阔混交林下(杨祝良等 2021),其中前两者是松属专性共生类群,而后者宿主范围广,与针叶树、阔叶树都可以共生。目前,国内外关于乳牛肝菌的研究多集中于对宿主植物苗木生长、对重金属污染地的适应和提高植物抗旱与抗病性等方面(Colpaert et al. 2004,2011;Krznaric et al. 2009;翟帅帅等 2015;Peng et al. 2021;尹大川和祁金玉 2021)。国际上,Yamada et al. (2001a,2001b)对点柄乳牛肝菌S. granulatus与赤松P. densiflora的菌根合成、菌根形态以及出菇状况进行了详细报道。然而,在早期EMF与松树共生特性、菌根技术与外来松引种、菌根型食用菌人工栽培(培育)等方面的研究则十分有限。

本研究选用源自本地的2种松(云南松和华山松)和墨西哥的2种松(P. greggii和P. maximartinensis),同时选取乳牛肝菌属、蜡蘑属的3种先期EMF,在控制条件下利用孢子接种方法进行菌根合成,通过菌根宏观与显微观察、分子鉴定和种苗生长效应分析,探讨早期EMF与松树的共生特性,以期为植被恢复、外来树木引种、菌根型食用菌人工栽培(培育)等提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验树种包括云南松P. yunnanensis、华山松P. armandii、P. greggii和P. maximartinensis 4种松,其中云南松和华山松种子来源于云南,P. greggii和P. maximartinensis种子来源于墨西哥。所有种子均保存于4 ℃下备用。供试菌种环褐乳牛肝菌S. luteus和虎皮乳牛肝菌S. phylopictus采自云南弥勒华山松林下,酒红蜡蘑L. vinaceoavellanea购于昆明茨坝菜市场。将真菌新鲜材料进行记录和拍照(图1),去除子实体表面杂质,再用75%乙醇进行消杀,最后取子实层部分4 ℃下保存备用。

图1 三种外生菌根真菌子实体

A：褐环乳牛肝菌;B：虎皮乳牛肝菌;C：酒红蜡蘑. 标尺=2 cm

Fig. 1 Fruiting bodies of three ectomycorrhizal fungi.

A: Suillus luteus; B: S. phylopictus; C: Laccaria vinaceoavellanea. Bars=2 cm.

Full size|PPT slide

1.2 育苗和接种

将松树种子表面清洁后浸泡于无菌水中并在4 ℃冰箱放置48 h,然后用30% H2O2消毒5-10 min;基质配比为松树皮、河沙和森林土(2:2:1,体积比),121 ℃、0.15 MPa灭菌2次,间隔2 d每次1 h,基质的最终pH值为5.5;将消毒好的种子播于含有灭菌基质的育苗盒(体积为668 mL)中,每盒播种3-5粒。待出苗后,每盆只保留1株与其他处理长势一致的苗备用。取乳牛肝菌、蜡蘑子实层(菌管、菌褶)各30 g,碾磨后置于100 mL无菌水中制成悬浮液菌剂,每盒(苗)接种5 mL,褐环乳牛肝菌、虎皮乳牛肝菌和酒红蜡蘑的接种孢子量分别为9×107个/株、1.8×108个/株和6.5×106个/株,对照苗加入5 mL无菌水。每个处理设9个重复,试验苗置于23-25 ℃培养间内,浇灌使用无菌水。

1.3 分子鉴定

为确认合成的菌根组合,采用Doyle & Doyle (1987)的方法提取子实体和合成菌根的DNA,其中菌根取3个左右,在体视镜下用毛刷刷掉表面基质并用蒸馏水清洗,再进行DNA提取。用ITS1F (5′-CTGGTCATTTAGAGGAAGT AA-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3′)引物进行核糖体DNA ITS区域的扩增(White et al. 1990;Gardes & Bruns 1993),扩增片段测序后所得序列用BioEdit编辑,在NCBI中进行比对(BLAST),将相似度≥98%且碱基差异5个以内的鉴定为同一种。本研究所产生的序列均已上传至GenBank。

1.4 菌根宏观和显微观察

接种6个月后,在体视显微镜下观察确认有菌根形成后,进行详细的菌根形态特征观察、记录和拍照;用镊子摘取新鲜菌根并清理表面基质,采用手动和冷冻切片机进行切片处理,通过光学显微镜下进行菌根解剖特征观察、记录和拍照。

1.5 菌根侵染和松苗长势分析

接种6个月后,计算菌根合成成功率(菌根合成成功率=形成菌根的松苗株数/接种的松苗总株数),并依据Murat (2015)的方法对菌根侵染率进行评估。

接种后第2、4和6个月分别测量松苗株高,并用Excel进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 菌根形成情况

接种6个月后,褐环乳牛肝菌和虎皮乳牛肝菌分别与4种松均形成了菌根(图2),而酒红蜡蘑仅与两种外来松P. greggii和P. maximartinensis形成了菌根(图3A,3B),与本地松无菌根形成。

图2 两种乳牛肝菌与4种松形成菌根的形态

A-D：褐环乳牛肝菌与4种松形成菌根的形态. A：云南松;B：华山松;C：Pinus greggii;D：Pinus maximartinensis. E-H：虎皮乳牛肝菌与4种松形成菌根的形态. E：云南松;F：华山松;G：Pinus greggii;H：Pinus maximartinensis. 标尺=0.5 mm

Fig. 2 The morphology of mycorrhiza formed by two species of Suillus and four kinds of pine.

A-D: The morphology of mycorrhiza formed by Suillus luteus and four kinds of pine. A: Pinus yunanensis; B: P. armandii; C: P. greggii; D: P. maximartinensis. E-H: The morphology of mycorrhiza formed by Suillus phylopictus and four kinds of pine. E: P. yunanensis; F: P. armandii; G: P. greggii; H: P. maximartinensis. Bars=0.5 mm.

Full size|PPT slide

图3 酒红蜡蘑与两种松形成的菌根以及3种ECM的菌根解剖结构

A,B：酒红蜡蘑与2种松菌根形态. A：Pinus greggii;B：P. maximartinensis,标尺=2 mm. C-E：3种ECM的菌根解剖结构. C：褐环乳牛肝菌与云南松的菌根横切面;D：虎皮乳牛肝菌与云南松的菌根横切面;E：酒红蜡蘑与P. greggii的菌根横切面. MT：菌套;HN：哈蒂氏网,标尺=20 μm

Fig. 3 Morphology of mycorrhiza of Laccaria vinaceoavellanea associated with two pine and anatomical structure of mycorrhizae of three ECM.

A, B: L. vinaceoavellanea mycorrhizal morphology associated with two pine. A: Pinus greggii; B: P. maximartinensis, bars=2 mm. C-E: Anatomical structure of mycorrhizae on P. yunnanensis roots colonized by three ECM fungi. C: Ectomycorrhiza cross-sections of Suillus luteus with P. yunanaensis; D: Ectomycorrhiza cross-sections of S. phylopictus associated with P. yunanaensis; E: Ectomycorrhiza cross-sections of L. vinaceoavellanea associated with P. greggii; MT: Matle; HN: Hartig net, bars=20 μm.

Full size|PPT slide

菌根侵染情况见表1,其中两种乳牛肝菌与华山松亲和性最高,菌根合成成功率达100%,且侵染率高达70%-90%。其次是云南松,分别与褐环乳牛肝菌和虎皮乳牛肝菌的合成成功率为88.9%和66.7%,且与褐环乳牛肝菌有77.8%的苗的侵染率高达70%-90%。另外,3种菌中,褐环乳牛肝菌与4个树种合成菌根情况最好,菌根合成成功率达81.6%,而酒红蜡蘑与4种松形成菌根的情况最差,菌根合成成功率仅为14.3%,其与本地两种松均未形成菌根,与外来树种P. greggii和P. maximartinensis形成的菌根仅有1株和4株,侵染率分别为40%-50%和1%-10%。对照苗根部未发现任何外生菌根,所有试验苗均未发现其他外生菌根真菌污染。

表1 三种早期真菌与本地和外来松不同组合的菌根侵染率

Table 1 Mycorrhizal colonization rates of different combinations of 3 early stage fungi with native and exotic pine species

树种
Tree species 褐环乳牛肝菌
Suillus luteus 虎皮乳牛肝菌
Suillus phylopictus 酒红蜡蘑
Laccaria vinaceoavellanea 高/中/低/无
High/moderate/low/no 高/中/低/无
High/moderate/low/no 高/中/低/无
High/moderate/low/no 云南松
Pinus yunnanensis 7/0/1/1 0/1/5/3 0/0/0/9 华山松
P. armandii 9/0/0/0 9/0/0/0 0/0/0/9 P. greggii 5/1/1/1 0/0/2/4 0/1/0/8 P. maximartinensis 0/0/6/3 0/0/2/7 0/0/4/4注：“高/中/低/无”：菌根侵染率高70%-90%/菌根侵染率中40%-50%/菌根侵染率低1%-10%/无菌根Note: “High/moderate/low/no”: High mycorrhizal colonization rate, 70%-90%/moderate mycorrhizal colonization rate, 40%-50%/low mycorrhizal colonization rate, 1%-10%/no mycorrhiza.

2.2 分子鉴定结果

本研究中所有从子实体和菌根中获得的ITS序列均上传到GenBank。从3种EMF子实体来源的ITS序列分别与GenBank中的褐环乳牛肝菌(MH878756.1)、虎皮乳牛肝菌(MK188416.1)和酒红蜡蘑(MW577310.1)具有100%、99.54%和100%的相似性。从褐环乳牛肝菌与云南松、华山松、P. greggii和P. maximartinensis形成的菌根中获得的ITS序列与GenBank中褐环乳牛肝菌参考序列(MH878756.1)分别具有100%、100%、99.69%和99.84%相似性;从虎皮乳牛肝菌与4种松形成的菌根获得的ITS序列与虎皮乳牛肝菌参考序列(MK188436.1)均展示出100%相似性;从酒红蜡蘑与国外两种松形成的菌根获得的ITS序列与GenBank中酒红蜡蘑参考序列(MW577309.1)均具有100%的相似性。所有保存在GenBank中的菌种子实体和菌根ITS序列号见表2。

表2 本研究产生的所有保存于GenBank中的ITS序列号

Table 2 ITS sequence deposited in GenBank determined in this study

序列来源
Sequence source 褐环乳牛肝菌
Suillus luteus 虎皮乳牛肝菌
Suillus phylopictus 酒红蜡蘑
Laccaria vinaceoavellanea 子实体
Fruiting body OL314626 OL314631 OL314636 云南松
Pinus yunanensis OL314627 OL314632 NA 华山松
P. armandii OL314628 OL314633 NA P. greggii OL314629 OL314634 OL314637 P. maximartinesis OL314630 OL314635 OL314638

2.3 菌根宏观和显微特征

同种EMF与4种松形成的菌根形态极为相似。褐环乳牛肝菌与4种松形成的菌根呈明显的二叉状或珊瑚状,菌丝白色,有外延菌丝和菌索结构(图2A-2D),菌套厚10-16 μm,排列紧密,在皮层细胞间隙有明显的哈蒂氏网(图3C);虎皮乳牛肝菌与4种松形成的菌根大部分呈明显的二叉状,部分为珊瑚状,菌丝浅黄色,有外延菌丝和菌索结构(图2E-2H),菌套厚16-23 μm,排列紧密,在皮层细胞间隙有明显的哈蒂氏网(图3D);酒红蜡蘑与两种外来松形成的菌根呈二叉状或珊瑚状,菌丝白色,有外延菌丝,无菌索结构(图3A,3B),菌套厚10-15 μm,排列紧密,在皮层细胞间隙有明显的哈蒂氏网(图3E)。

2.4 松苗生长效应

株高是衡量植物生长的重要指标,接种3种EMF能够提高除华山松外其他3种松的株高(图4),但不同组合的促进作用存在较大差异。接种虎皮乳牛肝菌能显著提高云南松的株高(P<0.01),但对其他3种松的株高无显著影响。接种褐环乳牛肝菌和酒红蜡蘑均能显著提高P. greggii (P<0.01, P<0.01)和P. maximartinensis (0.01<P<0.05,P<0.01)的株高,但对云南松和华山松株高的影响不显著。另外,接种3种EMF对华山松的株高均无显著影响。

图4 三种EMF接种对4种松苗高的影响

*表明不同EMF接种后与对照松苗高的显著性差异,*0.01<P<0.05, **P<0.01

Fig. 4 Effects of three EMF inoculation on seedling height of four species of Pinus.

* Indicates significant difference between the treatment and control of the same tree species. * 0.01<P<0.05, ** P<0.01. PY: Pinus yunnanensis; PA: P. armandii; PG: P. greggii; PM: P. maximartinensis.

Full size|PPT slide

在接种后第2月、第4月和第6月分别测量苗高,接种后半年内4种松苗高生长变化趋势见图5。接种两个月后,本地松(云南松和华山松)的苗高明显高于对照,而外来松与对照苗高则差异较小。接种4个月后,本地松未接种苗长势明显减缓,2种外地松未接种苗的长势分别表现出未明显减缓和长势加快的趋势,而所有接种苗均表现出持续的生长趋势。3种EMF接种对本地松和外来松在第2-4月、第4-6月长势的影响几乎一致。接种乳牛肝菌对P. greggii在第2-4月长势较第4-6月慢,但对P. maximartinensis的长势影响在第2-4月和第4-6月几乎一致。值得注意的是,接种酒红蜡蘑对P. maximartinensis在第2-4月、第4-6月长势的影响基本相同,明显优于接种乳牛肝菌。

图5 三种EMF接种后对4种松苗高动态变化的影响

A-D：4种松株高的动态变化. A：华山松;B：云南松;C：Pinus greggii;D：P. maximartinensis

Fig. 5 Effects of three EMF on the dynamic change of seedling height of four species of Pinus.

A-D: Dynamic change of seedling height of four species of Pinus. A: P. armandii; B: P. yunnanensis; C: P. greggii; D: P. maximartinensis.

Full size|PPT slide

3 讨论

以往乳牛肝菌和蜡蘑的菌根合成研究大多采用菌丝接种,本研究首次报道利用孢子接种成功合成2种乳牛肝菌与4种本地和外来松以及酒红蜡蘑与2种外来松的菌根,所形成的10种菌根组合皆为首次报道。显微观察发现,同一EMF接种不同种松所形成的菌根在形态和解剖特征上具有高度相似性,这种相似性受EMF遗传特性的影响,同样的现象也发生在Huang et al. (2021)对假喜马拉雅块菌Tuber pseudohymalayense与不同宿主合成的菌根中。然而,同属不同种EMF与同一种松形成的菌根,形态较为相似,但菌丝颜色上有明显差别,这种差异可为生产中菌根的形态鉴定提供重要参考。另外,本研究在控制条件下获得的乳牛肝菌菌根形态与Yamada et al. (2001a)用菌丝接种合成的菌根极为相似,而与冯万艳等(2019a)在野外采到的乳牛肝菌菌根形态差异显著,这可能是菌根生长环境或发育阶段的不同所致。本研究获得的蜡蘑菌根形态与Rodvíguez-Gutiérrez et al. (2019)用L. trichodermophora孢子接种P. fluorescens和P. montezumae获得的菌根相似,菌根表面均有一层薄薄的菌丝,但与其他EMF类群形成的菌根差别较大,这可能是不同菌种的遗传差异所致。另外,3种ECM的菌根解剖特征也较为相似,均在外层皮层细胞间形成明显的哈蒂氏网,仅菌套厚度存在一定的差异(图3C-3E)。

乳牛肝菌与松科植物专性共生,能与褐环乳牛肝菌形成菌根的有马尾松P. massoniana、樟子松P. sylvestris var. mongolica、油松P. tabuliformis、赤松P. densiflora和美国黄松P. ponderosa (Lu et al. 2016;冯万艳等 2019a, 2019b;Gonthier et al. 2019;Zhang et al. 2019)。目前,还未见关于虎皮乳牛肝菌和酒红蜡蘑菌根的报道。在我国西南虎皮乳牛肝菌主要生长在华山松等五针松下,而酒红蜡蘑则生于亚热带至温带阔叶林或针阔叶混交林中(杨祝良等 2021)。本研究发现酒红蜡蘑与两种外来松更加亲和,而乳牛肝菌与两种本地松的亲和性更高(菌根合成成功率更高),这可能与酒红蜡蘑的广谱共生和乳牛肝菌的专性共生特性有关,这为松树造林和引种中共生EMF的选择提供了依据。

多数研究表明EMF能促进宿主植物生长和养分(尤其是P)吸收,同时还能增强宿主的抗逆性(Colpaert et al. 2011;Yin et al. 2017;Shinde et al. 2018;Tedersoo & Bahram 2019)。本研究发现不同EMF对宿主生长的促进作用存在着较大的差异,从菌根苗的生长速率来看,本地树种较为接近,外来树种则相对更快,尤其是P. greggii,这表明EMF可能对外来树种具有更为重要的作用,因此在树木引种过程中,EMF应该作为一个重要因素考虑。另外两种乳牛肝菌接种后能促进云南松、P. greggii和P. maximartinensis的生长,但对华山松却没有显著影响,值得注意的是,华山松与两种乳牛肝菌形成的菌根情况最好,这可能与华山松的生长特性或试验的周期有关。接种EMF 2个月后本土松苗的长势就显著高于对照组,而外来松苗4个月后才表现出相同趋势,这意味着本土松和外来松在与EMF形成菌根的时间上可能存在着差异。研究仅在接种6个月后进行了菌根采样,宿主生长效应也仅对苗高进行了为期半年的测量分析,因此无法对菌根形成的时间、对宿主生长的中长期效应等做出判断和分析,需要开展进一步的深入研究。

本研究通过孢子接种合成了褐环乳牛肝菌、虎皮牛肝菌和酒红蜡蘑与松的菌根,与菌丝接种相比大大节约了时间和成本,其中3种EMF都具有一定的食用价值,有的还促进宿主的生长,这为松树菌根化育苗和部分食用EMF的人工栽培提供了重要方法和途径。

=2" class="main_content_center_left_zhengwen_bao_erji_title main_content_center_left_one_title" style="font-size: 16px;">{{custom_sec.title}}{{custom_sec.content}}