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农业植物病害研究中可培养性病原菌的常用保存方法

花匠小妙招
2024-09-15 13:57

　　摘要介绍了植物可培养性病原菌的几种常用保存方法，如甘油冷冻保藏法、冷冻干燥保藏法、滤纸保藏法、沙土保藏法、斜面低温保藏法、液氮冷冻保藏法和液体石蜡保藏法。
　　关键词农业植物病害研究；可培养性病原菌；保存方法
　　中图分类号 Q-34文献标识码A文章编号1007-5739（2008）20-0154-02

　　　　植物病原菌的保存是植物病害研究中一个必不可少的关键环节。菌种是农业植物病害研究中一项很重要的资源，其生物特性的稳定与否直接关系到试验的重复性。菌种保存方法及贮藏条件不适宜，就会导致菌种生活力下降、生物学特性改变，甚至菌种丢失。本文介绍了植物可培养性病原菌的几种常用保存方法。

　　　　1甘油冷冻保藏法

　　　　本方法适合于中、长期菌种保藏，保藏时间一般为2～4年左右。①用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落；②平皿倒置于30℃或37℃恒温培养箱，培养24～48h，至单菌落的大小为3mm左右；③挑取1个单菌落，接种于1个装50mL LB的300mL三角瓶中30℃或37℃振荡培养10～15h，至菌密度OD600为1.0～1.5；④用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态及是否有杂菌；⑤按30%甘油∶种子液为1∶1（V/V）的量加入无菌甘油，混合后分装至事先灭菌的菌种保存管（1～2mL/管），-70℃或液氮保存。

　　　　2冷冻干燥保藏法

　　　　此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用。即使对一些很难保存的致病菌亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至10余年，但设备和操作都比较复杂。
　　（1）准备安瓿管。用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管，大小要求外径6.0～7.5mm，长105mm，球部直径9～11mm，壁厚0.6～1.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2、121.3℃，灭菌30min，备用。
　　（2）准备菌种。用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至10余年。为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使其培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般细菌要求24～48h的培养物；形成孢子的微生物则宜保存孢子；丝状真菌则培养7～10d。
　　（3）制备菌悬液与分装。以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2mL左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0.2mL。
　　（4）冷冻。冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4～5min，即可使悬液结冰。
　　（5）真空干燥。为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至 -15℃。装置仪器，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。
　　抽气一般若在30min内能达到93.3Pa真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.7Pa，保持压力6～8h即可。
　　（6）封口。抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约10min即可达到26.7Pa。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。

　　　　3滤纸保藏法

　　　　细菌和丝状真菌均可用此法保藏，可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14～17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。①将滤纸剪成0.5cm×1.2cm的小条，装入0.6cm×8.0cm的安瓿管中，每管1～2张，塞以棉塞，1.05kg/cm2、121.3℃，灭菌30min；②将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长；③取灭菌脱脂牛乳1～2mL滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液；④用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞；⑤将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干；⑥将棉花塞入管内，用火焰熔封，保存于低温下；⑦需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴1滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。

　　　　4沙土保藏法

　　　　此法多用于能产生孢子的微生物，如霉菌、放线菌，在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好；但应用于营养细胞效果不佳。①取河沙加入10％稀盐酸，加热煮沸30min，以去除其中的有机质；②倒去酸水，用自来水冲洗至中性；③烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用；④另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性；⑤烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒；⑥按1份黄土、3份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10mm×100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干；⑦抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽1支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48h，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用；⑧选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液；⑨于每支沙土管中加入约0.5mL（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀；⑩放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12h内抽干；{11}每10支抽取1支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查；{12}若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查1次活力和杂菌情况；{13}需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。

　　　　5斜面低温保藏法

　　　　将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2～8℃的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有所不同，霉菌和有芽孢的细菌保存2～4个月，移种1次。细菌最好每月移种1次。
　　此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异。因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。

　　　　6液氮冷冻保藏法

　　　　此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物，难以形成孢子的霉菌均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。
　　（1）准备安瓿管。用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂。因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，通常使用安瓿管的大小为75mm×10mm，或能容1.2mm液体。

　　（2）加保护剂与灭菌。保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，将空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2、121.3℃，灭菌15min；若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂，如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1.05kg/cm2、大于121.3℃，灭菌15min。

　　（3）接入菌种。将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。
　　（4）冻结。将已封口的安瓿管以每1min下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，从而降低存活率。

　　（5）保藏。经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。

　　（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38～40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。

　　　　7液体石蜡保藏法

　　　　此法实用而效果好。霉菌和芽孢细菌可保藏2年以上不死，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。①将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1.05kg/cm2、 121.3℃，灭菌30min，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用；②将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子；③用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝；④将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。