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红网纹草组织培养外植体消毒方法研究

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  范诸平+王立雪+张彦妮
摘要:以红网纹草的顶芽、叶片、茎段为外植体,对其进行最佳消毒方法的研究。首先以叶片为外植体,筛选最适宜的次氯酸钠浓度和升汞浓度,即进行不同浓度次氯酸钠(1%,2%,5%)和升汞(%,%,%)的单因素试验。继而进行外植体(顶芽,叶片,茎段)、2%次氯酸钠消毒时间(0,5,10min)、%升汞消毒时间(0,5,10min)3因素3水平的L9(34)正交试验。结果表明:在单因素试验中,适合红网纹草外植体的次氯酸钠和升汞浓度分别为2%%;在正交试验中,茎段与叶片污染率相同,均低于顶芽,但茎段成活率最高,因而为理想的外植体,最佳的消毒方法是将茎段外植体在2%的次氯酸钠中消毒5min,%的升汞中消毒5min。此种消毒方法污染率和死亡率最低为0,存活率最高为100%,是适宜红网纹草的最佳消毒方式。
Key:红网纹草;组织培养;消毒方法;正交试验
::ADOI编码:.1006-
红网纹草(Fittoniaverschaffeltii)是爵床科草本植物,叶脉红色网纹状,耐阴湿、喜温暖,是一种珍贵的室内观叶植物[1]。主要以扦插或分株法进行繁殖,因北方地区冬季气温低不易发根,只能在春、夏两季育苗。由于常规方法受季节影响较大,且繁殖速度太慢,不能满足市场需要[2],因而可利用组织培养技术实现红网纹草的快速繁殖。
由于红网纹草茎段部位有较多纤毛,且叶背脉络较深,这为其组织培养中的外植体消毒带来一定困难,而有效的消毒方法是组织培养成功的前提和保障。不同植物材料、不同部位其消毒试剂和消毒时间不尽相同[3]。尽管近几年来国内开展了一些关于网纹草属的组织培养研究[1-2,4-9],但仅局限于白网纹草[1-2,4-8],关于红网纹草的组织培养研究仅有1篇[9],尚未见关于红网纹草组织培养消毒方法的研究报道。本研究旨在筛选适宜红网纹草组织培养的外植体、消毒试剂和消毒时间,为红网纹草组织培养的无菌操作提供技术支持。
1材料和方法

试验材料红网纹草购自哈尔滨市花卉市场,选取生长健壮、无病虫害的顶芽、叶片、茎段为外植体。

,先用洗衣粉水冲洗10min,再用流水冲洗10min,直至小烧杯中的洗衣粉泡沫冲洗殆尽。
在超净工作台上,将洗好的外植体移入已消毒的空瓶中,用75%的酒精浸泡30s,不断摇晃容器使外植体充分接受酒精的杀菌作用。倒出酒精,倒入无菌水涮
洗1次,然后按试验设计要求对外植体进行不同消毒试剂、不同时间的浸泡消毒。若消毒试剂为次氯酸钠,则用无菌水冲洗3次;若消毒试剂为升汞,则用无菌水冲洗5次,以充分消除残余升汞对外植体产生愈伤组织的抑制作用。
将已消毒的外植体置于铺有无菌滤纸的超净工作台上,使其充分吸收外植体表面的水分。剪掉顶芽外植体形态学下端与消毒试剂接触的部位,再将其剪成1cm左右的小段;剪掉茎段外植体两端与消毒试剂接触的部分,再剪成1cm左右的小段;剪掉叶片外植体四周与消毒试剂接触的部分,再剪成1cm2左右的小块。将3种外植体接种于MS+6-·L-1+·L-1的诱导培养基(%琼脂、25g·L-1蔗糖)上,~。培养室温度25℃,光照强度3000lx,光照时间16h·d-1。
:以红网纹草叶片为外植体,设置次氯酸钠1%,2%,5%%,%,%3个浓度水平的6组处理,每组处理均消毒10min,每个处理30瓶,每瓶接种1个外植体,试验重复3次。30d后,统计污染率、死亡率,筛选出最适合红网纹草的次氯酸钠和升汞浓度。
(34)正交试验筛选适宜的消毒试剂和消毒时间:在单因素试验基础上,进行外植体(顶芽、叶片、茎段)、2%次氯酸钠消毒时间(0,5,10min)、%升汞消毒时间(0,5,10min)3因素3水平的L9(34)正交试验[3]。按照表1、表2共进行9个处理,每个处理30瓶,每瓶1个外植体,试验重复3次。30d后,统计污染率、死亡率、成活率,进而探究出红网纹草外植体的最佳消毒方法。

利用Microsoftexcel软件制表,统计污染率、死亡率和成活率,利用SPASS统计分析软件进行方差分析,利用邓肯氏多重比较(Duncansmultiple-rangetest)检验其显著性,P>,P<,P<[10]。
污染率=×100%;
死亡率=×100%;
成活率=×100%;
2结果与分析

、成活率指标上,不同浓度的次氯酸钠处理之间差异均达到极显著水平(P<)。将外植体分别用1%,2%,5%的次氯酸钠处理10min,培养30d后,进行观察与统计,结果见表3。当次氯酸钠浓度为2%时,其污染率为3组中最低值(%),成活率为3组中最高值(%),其消毒效果最佳。当次氯酸钠浓度降低至1%时,其污染率增加,且成活率降低;当次氯酸钠浓度升高至5%时,其污染率与成活率均降低。由此可见,2%的次氯酸钠污染率最低,能保证较高的成活率,是适合于红网纹草的最佳消毒浓度。
、成活率指标上,不同浓度的升汞处理之间差异均达到极显著水平(P<)。%,%,%的次氯酸钠处理10min,培养30d后,进行观察与统计,结果见表4。%时,其污染率为3组中最低值(%),成活率为
3组中最高值(%),其结果为最佳。%时,其污染率上升,成活率随之下降;%时,%的升汞处理低,但成活率也处于较低水平。原因是升汞不易去除,高浓度的升汞残留在外植体表面对其造成毒害作用致其死亡。由此可见,%的升汞污染率最低,且对植物的毒害作用相对较小,能保证较高的成活率,是适合于红网纹草的最佳消毒浓度。

(表5),在死亡率、成活率两个指标上,不同外植体的消毒效果之间差异极显著(P<)。纵向比较可发现,叶片和茎段的污染率均低于顶芽,但茎段较叶片死亡率低且成活率高。显然,以茎段作为红网纹草的外植体是最佳选择。
,在污染率、死亡率、成活率3个指标上,次氯酸钠不同消毒时间的消毒效果都差异极显著(P<)。在污染率指标上,消毒时间0min最高(表6),%,消毒时间延长5min,污染率明显下降,%,%。但当消毒时间继续延长5min,污染率略有上升,猜测是红网纹草与次氯酸钠的化学反应所致,但仍待进一步研究考证。当消毒时间延长至10min时,由于次氯酸根的强氧化性致试验材料边缘白化以致死亡,%,显著高于其他两个处理,造成试验材料的浪费。由此可见,次氯酸钠的最佳消毒时间为5min。
,在污染率、死亡率、成活率3个指标上,升汞不同消毒时间的消毒效果差异极显著(P<)。在
污染率指标上,消毒时间为0min时最高(表7),%,消毒时间延长5min,污染率明显下降,%,%。消毒时间继续延长5min,虽然污染率得到有效控制,但死亡率显著上升,%,%,显著高于其他两个处理。猜测由于植物材料长时间浸润于升汞中,使升汞残留外植体表面造成植物的重金属中毒。由此可见,当升汞的消毒时间为5min时,能保证较低的污染率和死亡率,是理想的消毒时间。
(表8),正交试验中9个不同处理污染率、死亡率、成活率3个指标差异极显著(P<)。经比较,在污染率和死亡率指标上,处理2均为最低值0,且其存活率达100%。在其余8组处理中,处理3的污染率也较低,%,%,易造成植物材料的浪费。处理4~9中,污染率波动幅度不大,死亡率除处理4为0外,其余处理均相差不大,且在这6组中,%,与处理2相比还有很大差距。由此可见,处理2(A1B2C2:次氯酸钠处理5min,升汞处理5min)的污染率、死亡率最低,成活率最高,是适合红网纹草的外植体消毒方法。
3结论与讨论

保证无菌是组织培养成功的前提和后续试验能够顺利开展的基础,由于不同的外植体外部形态不同,因而消毒方式和消毒效果不尽相同。试验结果表明,茎段较顶芽和叶片污染率、死亡率较低,成活率较高,且较易产生愈伤组织,消毒效果较好,因而为理想的外植体。
叶片消毒效果较差可能与叶片上纤毛较多、叶背的网脉较深,以致消毒试剂难以深入有关。顶芽是植物最幼嫩的组织器官,所携带的微生物量比其他器官组织相对较少,但因其过于幼嫩,又极易被杀死,难以实现污染率和死亡率的同时降低[3]。不同外植体的消毒效果不同,还可能与不同基因在不同外植体的选择性表达、不同外植体经过消毒后产生的次生物质不同有关[11]。总之,原因较复杂,尚需进一步试验和研究。
此外还发现,在相同激素配比的培养基中,不同的外植体产生的愈伤组织形态不同。以叶片为外植体时,在叶片边缘和叶脉处产生白色愈伤组织;以茎段为外植体时,其形态学下端膨大产生绿色愈伤组织,茎节处芽萌发形成嫩叶;以顶芽为外植体时,顶芽下端亦膨大产生绿色愈伤组织(图1)。原因可能为相同的外界条件下,基因在不同部位的外植体选择性表达而产生不同的愈伤组织,仍需进一步试验探究。

由于基因的选择性表达,使得不同外植体的外部形态不同,因而消毒效果不尽相同。试验结果表明,最适宜红网纹草的消毒方式组合为A1B2C2,即将茎段外植体浸于75%的酒精中消毒30s,倒出酒精,倒入无菌水冲洗1次,再在2%的次氯酸钠中消毒5min,倒出次氯酸钠并用无菌水冲洗3次,%的升汞中消毒5min,倒出升汞并用无菌水冲洗5次。此消毒方法的污染率和死亡率最低,存活率最高,是最适合红网纹草的消毒方式。
消毒试剂和消毒时间的选择尤为重要。在众多消毒试剂中,本试验采用次氯酸钠和升汞进行外植体的消毒,选择适宜的时间,能够保证较低的污染率和死亡率,是较为理想的消毒试剂。消毒的同时,消毒剂会破坏外植体的细胞,细胞
出于自我保护,不断地产生大量次生物质,若消毒时间过长,会引起细胞毒害,导致外植体褐变甚至死亡;若消毒时间过短,外植体则会因消毒不彻底,而导致高污染率[12]。因而合理的消毒时间和消毒试剂是红网纹草外植体良好消毒效果的保证。
由图2可看出,在单因素试验中,相同的培养基浓度和消毒时间,单独采用升汞消毒的外植体产生愈伤组织的时间显著长于次氯酸钠,约长8d。原因可能为升汞残留造成外植体内部的一系列生理变化,延迟愈伤组织产生时间。
Reference:
[1]杨承勇,[J].仲恺农业技术学院学报,2000,13(1):15-18.
[2]冯林剑,梁明勤,[J].河南农业,2006(4):22-23.
[3]汪腾越,周再知,裘珍飞,[J].中南林业科技大学学报,2012,32(3):44-48.
[4]潘杰,吕俊英,苗红梅,[J].信阳农业高等专科学校学报,2005,15(2):69-70.
[5]陈超,王桂兰,石洪凌,[J].植物生理学通讯,2003,39(6):631.
[6]刘庆,张小玲,唐征,[J].温州农业科技,2004(6):68-71.

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