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基于RNA干扰的生物农药的发展现状与展望，未来5～10年有望实现零的突破

花匠小妙招
2024-09-15 21:51

RNA干扰又称转录后基因沉默，是一种能有效沉默或抑制目标基因表达的新兴基因工程技术。基于RNA干扰的生物农药被认为是未来植保领域的颠覆性技术，将极大改变人类防治农业病、虫、草等有害生物的思路和策略。

本文我们简单回顾了RNA干扰的基本作用机制和发展历程，全面总结了 RNAi生物农药的研究水平和应用现状，深入分析了 RNAi 生物农药发展面临的机遇和挑战，以及未来的发展前景。以期为我国 RNAi 生物农药的研发提供参考。

一、RNA干扰的基本作用机制

RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是真核生物中一种由RNA介导的保守调节机制，又称RNA沉默（RNAsilencing），是一种能以同源序列配对的形式靶向目标基因，在转录水平或转录后水平有效沉默或抑制目标基因表达的技术。RNA沉默现象在1990年首次被发现，Napoli等为培育颜色更深的紫色矮牵牛花，将查尔酮合酶（chalconesynthase，CHS）基因转入牵牛花中，然而多数花朵的颜色不仅没有加深，反而变为花白色或全白色，研究者将这种当外源转入的基因与内源基因同源时会导致两者的表达都被抑制的现象称为“共抑制”（co-suppression）。

1992年，Romano和Macino在粗糙脉胞菌Neurosporacrassa中首次发现外源转基因的沉默，称之为“抑制”（quelling）。1998年，Fire等发现在秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans中，双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）比单链RNA（single-stranded，ssRNA）能更有效地抑制靶标的转录表达，并将特异性基因转录后沉默这一现象称为RNA干扰，这一发现标志着RNAi革命的诞生。

RNA干扰最显著的特征就是能产生具有序列特异性调控功能的小RNA（smallRNA，sRNA）。sRNA在许多生物过程中发挥关键作用，包括维持RNA的稳定性及加工、生物和非生物应激反应，以及形态和发育事件的调节。真核生物转录组富含两种内源性sRNA：小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）和微RNA（micro-RNA，miRNA）。

siRNAs通常指一类20～24nt双链RNA分子，其由更长的前体加工而成，来源于基因组或外源性RNA序列，如病毒和转基因转录物。miRNAs是由主要从位于蛋白质编码基因之间的区域转录而来的、含有茎环结构的原初miRNA（primary-miRNA，pri-miRNA）产生的典型长度为20～22nt的单链非编码RNA（non-codingRNA，ncRNA）。通常，双链RNA或者分子内部能形成可折叠发夹结构的单链RNA可诱导RNA沉默。在沉默起始阶段，dsRNA是诱导细胞产生RNAi的关键成分。dsRNA前体在细胞内被称为Drosha和/或Dicer的RNaseIII样核酸内切酶加工成siRNA，然后siRNA在效应阶段与包含AGO（Argonaute）蛋白的核酶复合物结合，形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。

在大多数情况下，RISC在转录后水平负调节靶基因表达。RISC中的解旋酶将siRNA解旋为两条单链，其中的反义链引导RISC与同源的靶mRNA结合，RISC中核酸内切酶将靶mRNA切割，从而阻断其翻译成蛋白质的活性，引起靶基因沉默。在RNA聚合酶存在的情况下，可以触发次级siRNAs的发生，以增强沉默效应即为扩增阶段。

近年来，有许多综述从不同角度对RNAi在植物品质改良、植物抗虫、抗真菌病害领域的研究和应用情况进行了总结。其中Kim细化了从不同生物中克隆及鉴定新miRNA的标准：

1. 小RNA的表达能通过技术手段检测到；

2. 存在发夹状前体，且该序列中无大的凸起或环状结构；

3. 该序列在系统学上是保守的；

4. Dicer酶缺失突变会增加发夹状前体的积累，只满足上述条件之一不足以注释为一个新miRNA。

段成国等介绍了miRNA介导的RNA调控途径和siRNA介导的RNA沉默路径的异同：miRNA和siRNA在代谢上共享着一些相似的蛋白和路径，但二者来源及作用方式不同，为进一步理解真核生物基因表达调控的多层次性及复杂性奠定基础。

王爱英等着重介绍了RNAi在植物品质改良中的作用，当前RNAi技术在提升农作物品质（包括改良油脂、淀粉品质、提高植物营养物质或有效成分、降低有害物质含量）、改良园艺植物性状和提高植物果实品质等方面均有应用。王伟伟等总结了RNAi的作用机理及其在植物改良、生物防治、疾病预防和治疗中的应用进展并提出解决脱靶问题、提高靶基因的沉默效率是在实际应用中面临的巨大问题。

胡少茹等系统总结了RNAi在害虫防治方面的研究进展，并介绍了靶标基因选择、昆虫中肠核酸酶及不同昆虫dsRNA剪切方式对RNAi效率的影响，进而介绍了脂质体修饰和纳米粒子包被能提高RNAi效率，为该技术应用提供了重要参考。

本文对近年来RNAi技术在作物保护方面的研究进展进行了梳理，对使用RNAi农药的风险、益处及面对的挑战进行了归纳，通过总结RNAi在杀虫剂、杀菌剂等方面研究进程，以期对开发基于RNAi技术的生物除草剂提供借鉴和依据。

二、RNAi技术的发展现状及其在作物保护方面的应用

1. RNAi技术的发展现状

经过20年的发展，RNAi技术本身已处于成熟期。在医学领域，2018年8月，全球第一个RNAi医疗产品——Alnylam公司的Patisiran（商品名Onpattro，用于成人患者治疗由遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性引起的多发神经病）获美国FDA（FoodandDrugAdministration，食品药品监督管理局）批准上市，在RNAi药物发展史上具有里程碑的意义。

在农药领域，利用RNAi技术研发农药处于起步阶段。RNA农药是利用RNAi原理开发的仅针对病、虫、草等农业有害生物的目标基因而不影响农作物的遗传表达的一种新型生物制剂产品。RNA农药是具有高度特异性和系统性的全新机制药物，它结合了化学农药和转基因作物两种科技的优势，有望带来农业可持续发展道路上的又一次科技革命，是当前和未来科技战略必争的前沿领域。根据各公司公告数据显示，孟山都公司从2010年起每年投入数百万美元进行相关产品的研发，拜耳、先正达、陶氏化学和巴斯夫等化工巨头们也先后开始对RNA农药以及相关转基因产品的研发进行投资。预计在未来5～10年，以RNAi技术为核心的RNA农药将进入研发热潮，在农药市场上RNA农药有望实现零的突破。

虽然RNAi生物农药还处于起步阶段，但自从发现RNAi以来，科学家在开发这种独特的作物保护技术方面取得了许多成果。

2014年，Hu等通过注射将dsRNA输送到小菜蛾Plutellaxyllostella体内，增加了小菜蛾幼虫的死亡率，为解决昆虫抗药性提供了新思路。2016年，高梦烛等通过构建RNAi膜蛋白载体并将其导入转基因拟南芥，发现PMRP表达量的降低可增强拟南芥的抗寒性，为增强作物抗逆性提供了理论依据。

RNAi通过利用序列依赖的作用模式在信使RNA水平上发挥作用。由于设计了互补的dsRNA分子，具有高的靶向特异性，与传统的农用化学品相比，允许种植者更精确地瞄准特定的害虫。RNAi方法还提供了关于植物病害中涉及的宿主和病原体因素的重要线索，在某些情况下，RNAi诱导分子能够识别可被操纵的、影响病害发展的基因，这些基因就是靶标基因。靶标基因可以是植物内源基因、植物病原体基因（病毒和真菌）、其他害虫或杂草基因（昆虫、螨虫和杂草）。通过使用不同类型的RNAi诱导分子，例如发夹结构的hpRNA、人工微RNA（artificialmicro-RNA，amiRNA）和/或双链RNA，可以阻断这些靶标基因的功能。

2. RNAi的生物杀虫剂

据统计，昆虫导致的农业损失占总损失量的20%～40%。研究人员预计，未来几年，全球气温每升高1度，昆虫的为害就会增加10%～25%，这些为害主要出现在温带地区。常年使用大量化学杀虫剂已经导致一些昆虫对杀虫剂产生了很强的抗药性，这促使着人们必须寻求更有效的新型杀虫剂。

使用HIGS（host-inducedgenesilencing，宿主诱导基因沉默）和SIGS（spray-inducedgenesilencing，喷雾诱导基因沉默）技术开发RNAi生物杀虫剂，已被证明是传统杀虫剂的潜在替代品。自从真核生物基因沉默机制阐明以来，这种技术在害虫治理中的应用已经取得了重大进展。以前，RNAi曾被用作检测昆虫基因功能的工具，但Baum等开发了一种口服施用（通过人工饮食或转基因玉米）的RNAi方法，通过靶向各种液泡型ATP合成酶（vacuolar-typeATPase，V-ATPase）亚单位以及α-微管蛋白来诱导玉米根萤叶甲DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte死亡。同年，Mao等报道了通过喂食表达细胞色素P450基因的特异性dsRNA的植物叶片能抑制棉铃虫Helicoverpaarmigera的生长。这些研究为将RNAi技术应用到农业杀虫剂的开发中提供了可能性。最近，拜耳公司开发的能有效控制玉米根虫Diabroticavirgifera的转基因玉米‘SmartStaxPRO’（型号为MON87411）品种在加拿大（2016年）和美国（2017年）等多个地区被批准进行商业化种植，这被认为是RNAi技术在农业中应用的一个里程碑事件。近期，该品种得到阿根廷食用和种植的最终授权，在历经多年的监管审批过程，终于迈出了向农民推出的第一步。事实证明RNAi技术已经可以作为新的害虫管理工具提供给种植者。通过这种RNAi转化方法即研发转基因植物，在特定害虫中诱导基因沉默是一种极具良好发展前景的害虫管理方法。

此外，研究者们也探索了用非转基因的方式来应用RNAi技术，即外源施用dsRNA。然而，在植物中通过外源应用dsRNA来触发昆虫体内RNAi是一项具有挑战的任务。

首先，在被昆虫咀嚼/吮吸摄取之后，dsRNAs必须在具有唾液核酸酶的中肠或血淋巴中能够留存下来，因为核酸酶能迅速降解dsRNA。

其次，必须通过内吞途径或跨膜Sid-1通道蛋白介导途径从上皮细胞中摄取dsRNAs，由Dicer2加工成siRNAs，再装载到AGO2上并触发局部RNAi。因此，为了在整个昆虫体内建立有效的沉默系统，必须想办法让RNAi分子（dsRNA或sRNA）系统地扩散到相应的靶标细胞中。在植物和秀丽隐杆线虫中，RNAi的系统传播通过依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerases，RdRp）进行扩增，但一般昆虫基因组中缺乏RdRp蛋白基因。尽管存在这些障碍，但Baum等通过喂食表达dsRNA的转基因玉米成功诱导玉米根萤叶甲幼虫大量死亡的研究，证明了RNAi可以在昆虫中进行系统传播。事实上，尽管该过程具体涉及到哪些酶仍未被明确，但鞘翅目昆虫似乎也表现出了系统的RNAi扩散。

外源性的dsRNA能直接应用于植物抗虫是由Hunter等首次发现的，他们使用根部浸泡法和树干注射法，将针对亚洲柑橘木虱Diaphorinacitri、马铃薯木虱Bactericeracockerelli和玻璃翅叶蝉HomalodiscavitripennisArg激酶的dsRNA递送到来檬Citrusaurantifolia中，在单次施用7周后，在2.5m高的树中仍能检测到引入的dsRNA，而且取食了该植物的木虱和玻璃翅叶蝉体内也能检测到dsRNA的存在。随后，陆续有研究表明：在植物中外源应用体外转录/合成的dsRNA后，对害虫的控制都达到了显著的效果。2015年，Ivashuta等在番茄中施用靶向玉米根虫ATPase的dsRNA，提高了玉米根虫的死亡率。

Li等通过根浸泡让水稻和玉米直接吸收dsRNA，然后将吸收后的植株分别饲喂稻褐飞虱Nilaparyatalugens和亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis，都观察到了幼虫死亡率增高的现象。2018年，Ellango等将靶向小菜蛾酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase，TH）基因的dsRNA涂抹到甘蓝Brassicaoleracea叶片上让小菜蛾幼虫取食，结果发现幼虫死亡率大大提高。2019年，研究人员还发现，通过向烟草和豇豆植株喷洒含有菜豆普通花叶病毒Beancommonmosaicvirus（BCMV）外壳蛋白dsRNA的生物黏土纳米片，能保护植物免受蚜虫介导的病毒传播引起的BCMV感染。最近，Yan等通过更换纳米载体改进了大豆蚜虫上的经皮dsRNA传递系统。该系统能吸收喷雾法施用的dsRNA，并助其在4h内穿透蚜虫体壁，抑制靶基因的表达从而提高蚜虫死亡率。这些研究表明，dsRNA在作物保护中正朝着实际应用迈出重要的步伐。

有报道显示，孟山都公司正在通过一项名为“BioDirect”的技术来开发RNAi生物农药，通过外源施用dsRNA制剂来帮助植物抵御昆虫和病原体的攻击。该技术已经通过了研发过程的第一阶段，成功减少了马铃薯叶甲Leptinotarsadecemlineata幼虫对马铃薯的感染、成虫的出现和多个野外试验点的植物落叶；抑制了番茄斑萎病毒Tamatospottedwiltvirus（TSWV）的病毒浓度，降低疾病症状，改善番茄和胡椒的植物健康；成功控制了抗草甘膦长芒苋Amaranthuspalmeri和苋菜藤子（waterhemp）的生长。先正达公司的科学家也正在开发基于RNAi的生物防治产品，以保护马铃薯植物免受马铃薯叶甲的为害。

3. RNAi的生物杀菌剂

植物病原真菌是导致作物减产和影响全球粮食安全的主要因素。然而，化学杀真菌剂的大量、广泛使用往往会给人类健康和生态系统带来严重后果。因此，迫切需要更安全、环保的替代品。此外，一些杀真菌剂，如嘧菌酯或肟菌酯，由于抗性菌株的出现将不再高效。

为了克服这些问题，利用基因工程开发新的真菌病害防治方法被寄予厚望。2010年，Nowara等将表达靶向白粉病菌Blumeriagraminis葡聚糖转移酶基因Avra10的dsRNA转入大麦Hordeumvulgare中，成功增强了大麦对白粉病的抗性，正式开启了RNA沉默技术在真菌病害中应用的大门。2013年，Panwar等利用改进后的根癌农杆菌介导的瞬时表达系统，将含有小麦叶锈菌Pucciniatriticina基因PtMAPK1、PtCYC1和PtCNB的发夹状沉默构建体转入小麦叶片中，导致叶片中产生大量真菌基因特异性siRNA分子，进而导致叶锈菌内源靶基因的转录减少了近70%、小麦叶片病症减轻；他们还利用大麦条纹花叶病毒介导的RNAi系统，将叶锈菌基因片段递送至小麦中，也能提高小麦对叶锈菌的抗性。Koch等通过在植株中表达细胞色素P450羊毛甾醇C14α-脱甲基酶基因CYP51的RNAi结构，成功增强了拟南芥和大麦对镰刀菌属Fusariumspp.的抗性，这是通过HIGS方法提高植物抗性的优秀实例。

随后，Wang等也于2016年在拟南芥和番茄中利用HIGS沉默灰葡萄孢Botrytiscinerea的DCL基因，降低了灰葡萄孢的致病性。其实，Wang和他的团队在2013年已经发现，灰葡萄孢的sRNA分子可以转移到宿主植物细胞中，作为sRNA效应物抑制宿主免疫并实现侵染。这是第一次发现真菌病原体将sRNA传递到宿主细胞并“劫持”植物的证据。在灰葡萄孢侵染拟南芥Arabidopsisthaliana后，病原菌的Bc-siR3.2可以装载到AGO1上，并靶向参与植物免疫反应的丝裂原活化蛋白激酶基因MPK2和MPK1以及番茄MAPKKK4序列的转录物。

此外，氧化应激相关基因（PRXIIF）和细胞壁相关激酶（WAK）分别被Bc-siR3.1和Bc-siR5靶向。这种sRNA效应因子主要由RNA内切酶Dicer的同源蛋白（Dicer-like，DCL）Bc-DCL1和Bc-DCL2产生。此外，Bc-siR37能靶向3种免疫应答基因WRKY7，PMR6和FEI2，这3种基因编码的分别是免疫相关转录因子、果胶裂解酶、富含亮氨酸重复（leucinerichrepeat，LRR）的受体激酶，过量表达Bc-siR37的植物对灰葡萄孢表现出较高敏感性。最近，Hu等成功利用基于菜豆荚斑驳病毒Beanpodmottlevirus（BPMV）的HIGS抑制了豆薯层锈菌Phakopsorapachyrhizi在大豆中的积累，显著降低了叶片中大豆锈病症状的发展。所以，研发生产表达真菌同源基因序列的转基因植物是一种非常有前途的抗真菌方法。

最近一些研究表明，通过外源应用真菌、细菌产生的或体外合成的dsRNAs、siRNAs和hpRNAs诱导转录后基因沉默来提高植物对病害的抗性已成为一个有潜力的发展策略。例如，局部应用靶向禾谷镰孢Fusariumgraminearum麦角甾醇生物合成相关基因（CYP51A、CYP51B和CYP51C）的dsRNAs或siRNAs可抑制大麦中的真菌生长；用靶向亚洲镰孢菌Fusariumasiaticummyosine5的dsRNA喷洒小麦植株可降低真菌毒性；在欧洲油菜Brassicanapus中，外源应用靶向灰葡萄孢不同基因的dsRNAs可降低灰霉病的发病水平；外源应用针对灰葡萄孢siRNA生物合成相关蛋白（如DCL1和DCL2）基因的dsRNAs或siRNAs，显著减少了各种水果和蔬菜中的灰霉病；对大豆直接喷洒靶向病原菌目标基因的dsRNAs，可将叶片中豆薯层锈菌Phakopsorapachyrhizi的积累量降低75%。

4. RNAi的抗病毒制剂

研究表明，RNAi是植物抵抗病毒感染的防御机制之一。与真菌来源的siRNA类似，病毒来源的dsRNA也可以通过DCL加工成病毒来源的siRNA，然后引导AGO蛋白靶向宿主基因来减轻植物的病害症状。用携带宿主植物基因外显子片段的病毒载体来侵染植株能以序列特异性方式抑制病毒的基因表达。

Kamachi等用转基因技术转化烟草，在花椰菜花叶病毒Cauliflowermosaicvirus（CaMV）35S启动子的控制下，将含有黄瓜绿斑驳花叶病毒Cucumbergreenmottlemosaicvirus（CGMMV）外壳蛋白（CP）基因序列的反向重复RNA导入烟草，成功赋予了烟草对CGMMV的抗性，并能在抗性植株体内检测到CP序列的特异性siRNA。Shimizu等将水稻矮缩病毒Ricedwarfvirus（RDV）的非结构蛋白Pns12的特异性RNA干扰构建体引入水稻植株后，得到的植株体内积累了构建体特异性的siRNA，并且该水稻后代对病毒感染有很强的抗性。此外，Zhang等通过导入能表达几个较短但每个都包含一种病毒高保守序列的dsRNA，成功获得了对苜蓿花叶病毒Alfalfamosaicvirus（AMV）、菜豆荚斑驳病毒Beanpodmottlevirus（BPMV）和大豆花叶病毒Soybeanmosaicvirus（SMV）都具有抗性的转基因植株。这些结果证明了RNA干扰策略对于在主要作物中建立病毒抗性的有效性。

同样的，外源施用也适合防治病毒。2001年，Tenllado和Díaz-Ruíz将辣椒轻斑驳病毒Peppermildmottlevirus（PMMoV）、烟草蚀纹病毒Tobaccoetchvirus（TEV）、苜蓿花叶病毒分别与体外转录的977bp、1483bp和1124bp的dsRNAs机械接种在本氏烟草Nicotianabenthamiana叶片上，这三种dsRNA分别针对辣椒轻斑驳病毒复制酶、烟草蚀纹病毒辅助成分和苜蓿花叶病毒RNA3序列，结果发现PMMoV感染被减弱了。

当前，使用RNAi技术已经成功让许多植物获得了病毒抗性：如2010年，Gan等向玉米喷洒能表达靶向甘蔗花叶病毒Sugarcanemosaicvirus（SCMV）外壳蛋白dsRNA的大肠杆菌EscherichiacoliHT115(DE3)粗提取物，成功抑制了SCMV感染；2014年，Shen等对番木瓜Caricapapaya机械共接种能表达针对番木瓜环斑病毒Papayaringspotvirus（PRSV）外壳蛋白序列的大肠杆菌M-JM109lacY粗提取物，得到的多数番木瓜植株对PRSV有抗性，且抗性在接种两个月后保持不变；同年，Lau等通过在兰花Brassolaeliocattleyahybrida上机械接种能表达靶向建兰花叶病毒Cymbidiummosaicvirus（CymMV）的dsRNA的大肠杆菌HT115（DE3）粗提取物，成功减少了CymMV感染的症状；2016年，Konakalla等在烟草中通过机械接种针对烟草花叶病毒Tobaccomosaicvirus（TMV）p126的体外转录的237bpdsRNA，成功赋予烟草对TMV感染的显著抗性；2018年，Kaldis等对植株机械接种体外转录的、以小西葫芦黄花叶病毒（Zucchiniyellowmosaicvirus，ZYMV）辅助成分蛋白酶为靶标的dsRNA，使得黄瓜、西瓜、南瓜等植物分别获得了不同程度的抗性。由此可见，基于RNA干扰技术的抗病毒方法是未来农业中控制植物病毒的重要方法。

5. RNAi的生物除草剂

农田杂草是导致农作物减产的重要因素之一，在我国每年农田杂草危害造成直接经济损失近千亿元。目前，杂草的防治主要还是依赖于化学除草剂，然而人们在大规模使用化学除草剂的同时，也给环境造成了一系列的问题。此外，长期应用化学除草剂带来的杂草抗药性问题也越来越严重。迄今，全球71个国家95种作物中已有266种植物（包含153种双子叶植物和113种单子叶植物）对31类除草剂中的21类164种产生抗性。

面对上述问题，2013年孟山都公司研究人员在“全球除草剂抗性挑战”（GlobalHerbicideResistanceChallenge）国际会议上，介绍了利用RNAi技术进行草甘膦抗性杂草管理的探索试验结果。他们以靶标酶EPSPS突变的抗草甘膦长芒苋为试验材料，经室内盆栽和大田试验表明，通过向抗草甘膦杂草长芒苋导入特异性的双链RNA，能够导致长芒苋细胞内EPSPS基因沉默不产生5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，使其对草甘膦抗性丢失而恢复敏感性。这一结果表明可以直接利用精确的RNA片段来抑制植物体内5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶的正常产生。报告还指出，RNAi也适用于其他类除草剂抗性治理，包括ALS（AcetolactateSynthase，乙酰乳酸合成酶）抑制剂pyrithlobac-Na和氯嘧磺隆、氟磺胺草醚和硝磺草酮。由此可见，RNAi技术完全有潜力发展成为一种新的除草技术。

其实，在2011年的一项专利中，Sammons等就报道了在植物中应用外源dsRNA成功引发植物基因的RNA干扰的案例。他们用表面活性剂SilwetL-77对本氏烟草进行预处理，并喷洒体外转录的685bpdsRNA和化学合成的、针对内源性植物烯去饱和酶mRNA的21ntsRNAs，成功对该酶的基因进行了沉默。该专利是对外源dsRNA能引发植物基因RNA干扰的首次报道，建立了通过叶面施用dsDNA、siRNA、ssRNA甚至是DNA分子来下调编码植物除草剂抗性基因的转录水平的可能性。随后，陆续有文献报道可通过外源施用dsRNAs进行植物内源基因的调节。Lau等研究表明，将含有MYB1-dsRNAs的细菌粗提取物直接应用于石斛兰Dendrobiumhybrid的花蕾上，可抑制靶基因DhMyb1的表达，并改变了花细胞的表型（表皮细胞从锥形变成扁平）。

Li等研究表明，将拟南芥根系浸泡在含有dsMob1A的水溶液中，可抑制目标基因Mob1A的表达，拟南芥根的长度和数量受到显著抑制，植株不能抽薹或开花。将水稻根浸泡在荧光标记的dsEYFP（增强型黄色荧光蛋白）中24小时后，在水稻鞘、茎以及以水稻为食的褐飞虱体内能观察到荧光，且dsEYFP引起了RNAi关键基因Ago和Dicer转录水平升高。当把水稻根浸泡在dsActin中时，它们的生长也受到显著抑制。这些研究表明，被吸收的dsRNA可以触发植物RNAi。因此，利用外施dsRNA对作物进行RNA干扰来达到防除杂草的目的有较高的可行性。

三、RNAi生物农药存在的问题

1. 使用RNAi生物农药的风险和益处

虽然基于RNAi的生物农药具有高效、特异性高等特点，但不可避免地存在许多风险，主要表现在以下几个方面：

（1）潜在的偏离目标的影响。虽然RNAi被证明是高度序列特异性的，能定向降解目标转录物。然而，真核生物中RNAi途径的保守性意味着如果非靶标生物与RNAi药物存在足够的转录物同源性，那么施用该药物对非靶标生物的影响可能十分明显。非靶标效应包括对目标病原体体内非靶标RNA或作物其他组织中的RNA产生干扰作用。

如果将RNAi方法用于作物保护，则必须考虑潜在的无法预知的偏离目标的影响，但是这种影响是相对于天然存在的sRNA丰富度和RNA干扰活性来说的。sRNA测序已经清晰地表明植物中天然存在数百万种性质不同的sRNAs，植物病毒感染还会诱导寄主植物产生成千上万个性质不同的sRNAs，它们通常针对整个病毒基因组。现今，已有研究者观察到不同个体之间存在sRNA的转移（表1），杂草和作物之间也存在这种情况，如菟丝子Cuscutacampestris在寄生拟南芥时可将自身22个核苷酸的miRNA作用于拟南芥的mRNAs。

因此，若杂草与作物之间转移的sRNA包含了农药靶标基因，那么喷洒的农药将无差别攻击作物和杂草。既然RNAi在真核生物中无处不在、无时无刻不在发生，那么，在研发的早期对偏离目标的可能性进行评估是非常必要的。当前，保险的方法是使用不保守的目标基因，这一点在蜜蜂中获得了很好的证明，Arpaia等将蜜蜂对专门针对害虫的dsRNA没有敏感性这一现象进行了细致的总结。随着生命科学技术的飞速发展、基因组数据的快速积累，未来通过进行更细致的比较，使用计算机程序来设计和分析潜在的有效siRNAs和dsRNAs，能够尽可能减小甚至消除目标偏离的影响。

表1 跨物种转运的 sRNAs 及其作用靶点

（2）病原体和害虫对RNA农药的抗性。植物病原体及害虫是否会对基于RNAi的控制策略产生抗性？答案是肯定的，它们会在不同程度上针对某些目标产生抗性。当然，并不是只有在使用RNA农药时病原体和害虫才会产生抗性，许多植物病原体的抗性变异在使用传统的植物疾病控制策略时早已出现。抗病毒RNAi可以赋予转基因植物对病毒近乎免疫的抗性能力，但有报道称病毒抗药性的发生破坏了植物对这种病毒的抗性。

Simón等发现，带有miRNA靶序列的Plumpoxvirus（PPV）病毒嵌合体通过靶序列中的突变逃脱了RNA沉默。有研究表明，可破坏基于RNAi的转基因植株的病毒可以在实验室条件下产生，也可在田间自然发生。Lafforgue等在实验室条件下用25个独立的芜菁花叶病毒Turnipmosaicvirus（TuMV）种群在完全易感的野生型拟南芥中进化，通过侵染抗病毒感染的转基因拟南芥来定期检测逃逸突变体的存在，进而观察到抗性破坏病毒逐渐增加。然而，这些变异体是否能与其他自然发生的病毒竞争还不得而知。不过，有一点十分重要，虽然已经出现了相应的抗性破坏病毒，但是基于RNAi的转基因抗病毒番木瓜和南瓜在田间试验中对病毒的抗性水平仍然非常高。

（3）病原体相互作用对RNA干扰效率的影响。基于RNAi生物农药的另一个潜在不良影响可能来自混合感染。RNAi可能单独对靶标有效，但与另一个病原体复合侵染可能会影响其效果。Song等将含有李属坏死环斑病毒Prunusnecroticringspotvirus（PNRSV）反向重复序列的RNAi载体转入两种樱桃砧木，一种樱桃砧木对PNRSV敏感（Gisela7），另一种对PNRSV和李矮缩病毒PrunedwarfVirus（PDV）耐受（Gisela6）。当植物受到PNRSV和PDV（CH39）混合物的攻击时，两种转化体都表现出对病毒的抗性，对两种病毒耐受的未转化Gisela6虽未表现出病状，但体内能检测到PNRSV，这表明PNRSV和PDV之间的相互作用可能导致RNAi的保护作用减弱。实际上，共同感染的病毒之间发生相互作用从而对植物的抗性产生不利影响的现象并不令人惊讶，因为抗病毒植株被天然病毒感染过程中也可能出现这样的现象。

当具有番茄黄化曲叶病毒Tomatoyellowleafcurlvirus（TYLCV）抗性基因Ty-1或其等位基因Ty-3的转基因番茄被TYLCV和黄瓜花叶病毒Cucumbermosaicvirus（CMV）混合感染时，植株的抗性会受损。

（4）环境因子对RNA干扰的影响。许多研究表明温度对植物中的病毒感染有直接影响。温度的影响与RNAi活性直接相关，因此，对于田间那些受RNAi保护的植物来说，温度很有可能影响植物的抗性续航力及RNA沉默效力。暴露在极端温度下会导致病毒感染发生变化，如热掩蔽过程中被感染植株的病毒症状减少，而在低温期病毒症状激增。

Szittya等表明，转基因和病毒诱导产生的建兰环斑病毒（Cymbidiumringspottombusvirus，CymRSV）siRNAs在高温时增加，这种增加会导致病毒积累的减少和病害的减弱，而低温则抑制了siRNAs的产生。Ghoshal和Snafac指出，温度也能直接影响RNA沉默所涉及的酶，比如不仅在RNA干扰中起作用，也在抑制mRNA翻译中起作用的AGO1。

他们发现，高温下植物病害症状的恢复不是依赖于病毒RNA的清除，而是与番茄环斑病毒（Tomatoringspotnepovirus，TomRSV）RNA2编码的外壳蛋白与肌动蛋白的减少有关。当AGO1基因发生沉默时，番茄环斑病毒RNA2的翻译被抑制，阻止了症状恢复，这与低温条件下发生的现象类似。由此可看出温度变化与植物防御之间存在复杂的相关性。

2. 使用非转基因方式应用RNAi技术的可行性

尽管，RNAi在翻译过程中的作用已经被证明，然而，未来仍需要更多的研究去阐明这项技术进而开发全新的生物农药。虽然不少事实已经证明，基于RNAi技术的生物农药发展潜力巨大、前景美好，是新兴的颠覆性前沿技术和植保领域未来重要的发展方向，但在实际发展中仍未上升到战略高度予以重视，这可能与监管批准、公众认知以及相关的成本有关。即使出现基于RNAi的抗性作物，也会因为大众缺乏对这项新技术的科学认知而不受认可，从而导致类似反转基因的公众反应。近年来，基于RNAi的病毒和昆虫控制方法被商业批准的例子越来越多（表2），许多大规模的田间试验也正在进行中，这就证明了基于RNAi的植物病害控制策略的潜力是巨大的。我们有理由相信，随着应用越来越广泛，大众会慢慢意识到RNAi技术的巨大价值。然而，鉴于转基因植物的开发和维护成本高、公众接受态度复杂的状况，外源应用具有引发RNAi潜力的RNAi分子以诱导基因沉默被认为是基因转化的一种替代方法，可以提供类似的益处，而不会危及生态稳定，且社会接受度较高，目前的证据显示，饮食中RNAi分子的存在对人类没有威胁。

表2 植物中基于RNAi方法抵御病毒和昆虫的商业批准实例

目前，科学家们正在寻找非转化方法来控制昆虫、疾病、线虫和杂草，通过局部施用方式成功吸收药物已经在不同的生物体中得到报道。可见，在植物中局部应用病原体特异性dsRNA来保护作物是利用RNA干扰技术的一种有效方法。预计将来基于RNAi的生物农药将以可喷洒产品的形式进入市场，通过叶面施用、树干注射、根浸或种子处理等方式作为直接控制剂。外源性地将dsRNA分子应用到植物中对抗不同目标需要根据具体的防除对象进而选择合适的施用方式。

当用于对抗植物内源基因或病毒时，RNAi应该发生在植物细胞内，因此，最合适的方式是高压喷雾，因为它允许dsRNA通过共质体途径输送。当防除对象是昆虫和真菌时，RNAi应该发生在昆虫和真菌细胞内，因此昆虫和真菌需要摄取完整的dsRNA（未被DCLs加工）以获得有效的基因沉默。真菌细胞可以通过两种途径吸收dsRNA，一种是真菌细胞直接吸收RNA分子。

Qiao等通过比较致病真菌、卵菌和非致病真菌对dsRNA吸收效率，发现灰葡萄孢、核盘菌Sclerotiniasclerotiorum、立枯丝核菌Rhizoctoniasolani、黑曲霉菌Aspergillusniger和大丽轮枝菌Verticilliumdahliae能够有效吸收dsRNA，有益真菌绿木霉菌Trichodermavirens吸收dsRNA效率较低，而胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides却不能吸收dsRNA。致病疫霉对dsRNA的吸收效率较低，病原菌的不同细胞类型和发育阶段也影响dsRNA的吸收效率。通过防病效果检测发现，SIGS对dsRNA吸收效率高的病原菌具有较好的防治效果，可以显著抑制病害的发生。相反，SIGS无法抑制吸收效率低或不能吸收dsRNA病原菌的致病力。所以，当防治对象为dsRNA吸收率高的病原菌时，采用低压喷雾法（其中dsRNA停留在叶表面）更合适。

另一种是RNA分子先被植物细胞吸收然后再转移到真菌中。在这种情况下树干注射、叶柄吸收是最合适的方法，因为它们不会导致dsRNA通过共质体传递。需要特别注意的是，虽然树干注射和/或叶柄吸收是防除木质部取食和/或咀嚼类昆虫的理想方法，但喷雾法更适合韧皮部取食昆虫（如蚜虫）。

3. 使用非转基因方式应用RNAi技术面对的挑战

RNAi效应只有在连续供应dsRNA时才能维持，然而，喷洒在植物上的裸dsRNA的不稳定性一直是其实际应用的主要挑战。dsRNA在喷洒后，会被环境中的RNA酶和/或紫外线辐射降解。所以在田间条件下，基于RNAi的农药需要在植物生长后定期施用，以确保防治效果。考虑到这点，一家名为RNAgri（前APSE）的生物技术公司开发了一种系统，其中用APSE技术制造的RNA容器（APSERNAContainers，ARCs）由大肠杆菌生产，这种系统可以大规模生产封装的即喷型dsRNA。

此外，为防止dsRNA在递送至使用点之前发生降解，使用纳米载体作为递送系统的组件不失为一种选择。Mitter等证明了使用双氢氧化物（layereddoublehydroxide，LDH）黏土纳米粒子输送系统能够在叶片表面维持稳定且持续的dsRNA供应，它能在新叶片中提供抗病毒保护。黏土纳米片是一个极好的工具，可以将病毒病原体的防护时间延长至20d或更长，也可以使用生物层来锁定作为病毒传播媒介的害虫，还可以用于研究dsRNA的摄取和系统转运机制。然而，这种方式对生产成本和开发的纳米载体的效率有很强的依赖性。近来，有文章报道，通过沃森-克里克碱基配对，使用DNA纳米结构作为RNA载体工具，能有效地将siRNA传递到植物细胞中。三维四面体、一维发夹瓦、一维纳米线等DNA纳米结构能促进21nt绿色荧光蛋白（Greenfluorescentprotein，GFP）sRNAs在本氏烟草叶片中的传递和生物学作用。

在实际应用中，必须考虑纳米结构上siRNA附着位点的致密性、硬度、大小、形状和位置等参数，以确保纳米结构能有效地进入植物细胞，从而获得良好的基因沉默效率。有研究发现，纳米颗粒向植物细胞的传递效率取决于颗粒大小和电荷。与中性纳米材料相比，具有大于20或30mVzeta电位的带电纳米颗粒更有可能被植物细胞膜或叶绿体膜吸收。随着纳米颗粒尺寸的减小，它们的电位会增大，从而能更有效地通过细胞壁和脂膜。碳纳米管也已成功用于将生物分子运输到植物细胞中。Demirer等开发了一个基于纳米管的平台来直接传递siRNA，并在完整的植物细胞中显示出较高的沉默效率。他们证明，纳米管能成功传递siRNA和沉默内源性基因，是由于有效的细胞内传递和纳米管诱导的保护siRNA免受核酸酶降解。

Schwartz等通过将siRNA包装在碳点（一类非常小的纳米粒子）中，建立了一种用于植物基因沉默的新工具。他们将纳米制剂与表面活性剂一起低压喷雾施用，成功沉默了本氏烟和番茄中绿色荧光蛋白基因。此外，编码镁螯合酶（叶绿素合成所必需的一种酶）两个亚单位的内源性基因的沉默也证明了碳点制剂的递送功效。

高昂的RNA生产成本与超大的田间用药量之间的矛盾是未来RNAi生物农药应用面临的现实问题。农业生产中，病、虫、草等的田间规模管理需要数以吨级水平的RNAs。粗略估计表明，每公顷田地需要有10克的RNA，而且这一数量还因防除目标对RNAi的敏感性及其系统性RNAi传播能力而存在差异。但是，迄今为止，昆虫和疾病管理研究中常用的RNAi诱导分子（dsRNA或siRNA）是昂贵的合成物，或者是通过耗时费力的程序产生的。

为了克服这些方法的不足，科学家们已经研究了在细菌中表达的dsRNA的递送潜力，为大规模靶基因筛选提供了替代方法。令人鼓舞的是，dsRNA生产成本在过去几年大幅下降，使用核苷三磷酸（Nucleosidetriphosphate，NPT）体外合成的dsRNA从2008年的每克12500美元降至2018年的每克不到60美元。

最近，为了满足高市场要求，一些工业公司正在研发基于微生物的生物合成生产系统，以较大规模和接近2美元每克的价格生产dsRNA。大规模dsRNA生产系统，可以在降低成本的前提下实现高产量。这些生产系统涉及的基于酶促合成的两条单链RNA的杂交在体外或体内都能进行。

四、展望

总之，RNAi生物农药的研发和成功应用必须解决好以下几个关键的问题：

1. 基因沉默靶标基因的选择，如何筛选针对防治对象（如病原体、昆虫、杂草等）靶标基因的dsRNA序列是该技术的第一关键步骤；

2. 如何选择dsRNA运载体系使其能够高效特异的进入细胞，并有效地进行目标基因的沉默；

3. 如何保障外源dsRNA使用过程中的生物安全。各物种之间的部分关键基因在序列上也具有一定的差异性，这些差异序列则可作为靶标进行沉默用于控制特定种属的有害生物。已有的研究表明细菌和病毒都具有将外源dsRNA携带进入植物细胞的能力，但是它们具有物种、植物组织部位和发育时期的依赖性。

因此，如何优化外源dsRNA在自然环境下高效进入各种目标生物细胞中的途径，并高效地执行其沉默功能，是影响该技术实现的核心障碍之一。同时，在自然环境下广泛地使用携带特定dsRNA的细菌或病毒将对环境构成威胁，因此如何有效地清除所用的细菌或病毒，同时降解它们所携带的外源dsRNA，消除生物安全隐患，将是影响该技术实现的另一核心障碍。

毫无疑问，将RNAi应用于农作物保护无疑具有很多优点，特别是能够特异性地靶向已知的核苷酸序列，并有望减少植物病害、减轻环境负担。近年来，一些研究发现简化了其应用程序，降低了生产成本。此外，研究者们还进行了一些探讨，其目的在于使RNAi的使用变得更加有效和安全。尽管外源dsRNAs的识别、吸收和转运机制仍有待确定，但最近的研究表明使用局部施用的RNA农药作为作物保护措施的潜在益处有很多，包括相对于许多现有农药而言的低毒性、物种特异性以及当设计了合适的dsRNA序列时对环境的友好性。所以，如果谨慎地进行构思和开发，RNA农药能够以安全有效的方式彻底改变田间病虫害及杂草的管理体系。

来源于《中国生物防治学报》2022年第38卷3期