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一种甜樱桃花粉的快速收集和超低温长期保存方法与流程

花匠小妙招
2025-01-01 06:58

本发明涉及果树栽培技术领域，具体涉及一种甜樱桃花粉的快速收集和超低温保存方法。

背景技术：

甜樱桃由于具有结果早、见效快、单位面积产值高、绿色安全等优点，近年来在果树栽培中发展势头迅猛，已成为设施果树栽培、观光果树采摘、休闲旅游最重要的树种之一。以河北省为例，近5年来甜樱桃面积以每年15％的速率剧增，已经成为河北省农(果)业增值、农民增收的重要贡献力量。中国的甜樱桃种植区域已由过去的环渤海湾地区扩展到内陆，又进一步发展到南方沿海、西部高海拔地区、东北高寒地区等25个省市自治区，对果树产业、农业和农村经济发展都有着重要的作用和影响。

然而，在甜樱桃生产迅速发展的同时，甜樱桃栽培中也存在不少问题，特别是由于目前的甜樱桃品种大多自交不亲和，自花结实率很低。在北方地区，由于甜樱桃开花时间早，花期又常遭遇低温等不良气候伤害；此外，在设施栽培过程中甜樱桃花芽分化期易遭受高温等不良气候的影响；这些因素均可造成花粉活力降低，导致落花落果，使得甜樱桃的坐果率波动变化很大，极大地影响了甜樱桃的经济效益。

申请人通过对秦皇岛地区5个甜樱桃栽培品种进行了连续三年的跟踪调查，结果发现检测的5个品种(红灯、早大果、美早、玲珑脆和早蜜露)的自花结实率均为零，而这5个品种的田间自然授粉结实率不仅在品种间，而且在同一品种的不同年份中也存在明显差异(图1)，5个品种的最低自然授粉结实率分别为(27.5％、12.0％、9.1％、29.4％和9.1％)，最高自然授粉结实率则分别为(52.2％、40.1％、40.3％、56.1％和37.3％)。因此在栽培过程中采用人工辅助授粉对于保持甜樱桃产量的稳定、改善果实品质和提高经济效益具有重要意义。

然而，在甜樱桃栽培过程中采用人工辅助授粉的示范和推广效果不尽如人意，通过进一步的调查研究，申请人发现甜樱桃人工辅助授粉的大范围应用需要解决两个方面的制约因素：一是甜樱桃花粉活力波动幅度大，不同品种、不同生长环境、不同年份的甜樱桃花粉活力差异很大；二是甜樱桃花期集中，只有一周左右，且花期气温常波动较大，因此花粉收集时间非常短。针对以上两个技术问题，亟需开发高效的甜樱桃花粉收集和长期保存方法，为甜樱桃的人工授粉提供花粉来源。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种甜樱桃花粉的快速收集和超低温保存方法。利用该方法能够实现对选定年份、条件下产生的高活力花粉进行快速收集和超低温长期保存，可一次性解决以后多年内甜樱桃栽培人工授粉的花粉来源问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种甜樱桃花粉的快速收集和超低温保存方法，所述方法包括：将新鲜的甜樱桃花朵经干燥预处理、粉碎过筛后，收集花药，将所述花药经干燥处理后收集花粉，将所述花粉进行超低温保存。

尽管超低温保存是较为常用的植物组织保存方法，但是，不同于其它植物组织的保存，经保存后的花粉多用于人工授粉，因此对于活力的要求很高。而由于超低温保存过程中过低的温度环境、花粉细胞内的冰晶形成等原因，使得超低温保存过程中花粉的活力很容易受到损伤。由于甜樱桃品种大多自交不亲和，使得其结实更大地依赖于人工授粉，这使得花粉收集和超低温保存中活力的保持对于甜樱桃而言更为重要。同时，由于甜樱桃花期较短，人工剥粉不利于快速进行大量的花粉收集，因此还需在配合超低温保存保证花粉活力的同时保证花粉的收集效率。本发明发现，将采集的甜樱桃花朵通过两步干燥处理分别降低花朵和花粉的含水量，并在两步干燥中间进行粉碎过筛，能够在更好地配合后续超低温保存过程，保证花粉活力的同时，有效提高花粉收集的效率。

为保证收集和保存花粉的质量，可在采集新鲜花朵前，对甜樱桃的花粉活力进行测定，当花粉活力能够满足栽培要求时，再继续进行花粉收集和超低温保存。

进一步地，本发明发现通过控制花朵干燥和花粉干燥的温度和含水量，可以在更好地保证超低温保存花粉活力的维持的同时，将花药更好地干燥散粉，并使得花粉快速高效地与杂质分离(若预处理时间过短，则不能将花药从花朵上分开，若时间过长，花朵过于干燥，则粉碎时花朵也会打成粉末，难以与花药分离)，提高花粉的收集效率。

作为优选，所述干燥预处理为在30-37℃干燥至所述花朵的含水量为30％-40％。更优选地，所述干燥预处理为在35-37℃干燥8-12小时。

作为优选，所述干燥处理为在25-35℃干燥至所述花粉的含水量为10％-20％。更优选地，所述干燥处理为在25-35℃干燥8-24小时。

更优选地，所述干燥处理为在25℃恒温干燥12-24小时，或在35℃恒温干燥8-12小时。

本发明中，粉碎可采用本领域常规的粉碎方法，例如采用小型粉碎机，以10000-20000转/分粉碎1-2分钟。

作为优选，所述粉碎过筛为将花朵粉碎后过20-50m筛，将花瓣等杂质去除，收集花药。

为进行花粉的长期保存，所述超低温保存为在低于-150℃条件下保存。优选为置于液氮(-196℃)中保存。

经超低温保存的花粉，在进行人工授粉前，需经化冻处理。作为优选，在进行人工授粉前，将超低温保存的花粉于25-30℃水浴化冻2-4分钟。

本发明发现对于上述甜樱桃花粉的超低温保存方法，相比与梯度升温的化冻方法，采用上述快速化冻的方法能够更好地保持花粉的活力，提高人工授粉的结实率。

在人工授粉过程中，当从超低温保存中取出的花粉已进行化冻处理，但不再需要进行人工授粉时，对于剩余的花粉，需要再次进行超低温保存。本发明发现，经化冻后的花粉再次进行超低温保存前，需在-20℃条件下保存，再置于液氮中保存，在-20℃条件下保存时间不能超过7天。

为更好地保证收集花粉的质量，本发明中，对于在采集花朵前进行花粉活力的测定和花朵的采集优选在甜樱桃花朵的大气球期。

作为优选，本发明所述的甜樱桃花粉的快速收集和超低温保存方法包括如下步骤：

(1)花粉活力测定：测定处于大气球期的甜樱桃的花粉活力，若花粉活力满足栽培要求，则继续进行步骤(2)；

(2)大气球期花朵采集及干燥预处理：采集处于大气球期的甜樱桃花朵，将花朵于35-37℃恒温干燥8-12小时；

(3)花粉收集：将干燥后的花朵用粉碎机粉碎后，将粉碎物过20-50m筛，收集花药，将花药在25-35℃干燥8-24小时，收集花粉；

(4)花粉超低温保存：将花粉用硫酸纸包好，置于冻存管中并投入液氮中保存；

(5)花粉的快速化冻、使用和再次超低温保存：将储存在液氮中的花粉取出后，快速置于25-30℃水浴化冻2-3分钟后进行人工授粉；在人工授粉过程中，若有剩余花粉，用硫酸纸包好后于-20℃条件下保存不超过7天后，再置于液氮中保存。

更优选地，步骤(1)中，所述花粉活力测定采用离体萌发法，所用的萌发培养基包含：10-15％蔗糖，0.01-0.02％硼酸，1-1.5％琼脂。

作为本发明的一种优选方案，本发明所述的甜樱桃花粉的快速收集和超低温保存方法包括如下步骤：

(1)花粉活力测定：

采集处于大气球期甜樱桃品种的花朵，将花粉粒均匀涂在无菌的萌发培养基上，在25℃条件下培养24小时后，观察并统计花粉萌发率，选取花粉萌发率能够满足栽培要求的甜樱桃品种进行后续花粉收集和保存步骤；所述萌发培养基包含：12％蔗糖，0.015％硼酸，1％琼脂；

(2)大气球期花朵采集及干燥预处理

于晴好天气上午8点到10点，采集步骤(1)中选定的甜樱桃品种的大气球期花朵，将花朵平铺在托盘上并放入35℃恒温干燥箱内干燥预处理8-12小时，使得花朵含水量达到30-40％；

(3)花粉收集

将花朵从恒温干燥箱中取出放入小型粉碎机，以10000-20000转/分，粉碎1-2分钟，将粉碎物过20-50m筛，将花瓣等杂质过滤后收集花药；将花药在25℃干燥12-24小时或在35℃恒温干燥箱内干燥处理8-12小时，使得花药干燥散粉，花粉含水量在10-20％，收集花粉；

(4)花粉超低温保存

将花粉用硫酸纸包好，放入冻存管中，直接投入液氮保存；

(5)花粉的快速化冻、使用和再次超低温保存

将液氮中保存的装有花粉的冻存管取出，快速投入25℃水浴中化冻2-3分钟，取出全部花粉用于田间人工授粉；或者，取出部分花粉，将剩下的花粉用硫酸纸包好后放入-20℃冰箱进行不超过7天的短暂保存，若确定不再使用，将上述短暂保存的花粉放入冻存管再次投入液氮进行长期保存。

本发明还提供所述甜樱桃花粉的快速收集和超低温保存方法在甜樱桃育种、甜樱桃栽培或提高甜樱桃人工授粉的花粉质量中的应用。

本发明的有益效果至少包括：

(1)本发明针对甜樱桃花粉活力受气候环境影响大的特点，在花粉收集前首先测定花粉活力，只选取花粉活力高的品种进行花粉收集；

(2)本发明针对甜樱桃花期短，花期气候复杂等特点，采取简单快速的方法，在短时间内收集大量花粉，效率远高于常规的人工剥取花粉，且能够更好地与后续超低温保存方法配合，保证经保存花粉的活力；

(3)本发明的花粉保存采用液氮超低温保存，可将花粉长期进行长达数年的保存，保存花粉的活力与新鲜花粉相比没有显著降低，仍能实现较高的结实率；并且化冻后的花粉可再次进行超低温保存，其实用性大大增强；

(4)利用本发明提供的方法所保存的花粉可解决田间或设施栽培中甜樱桃品种花期不遇的问题。

综上，利用本发明提供的花粉快速收集和超低温保存方法既能够提高甜樱桃花粉的收集效率，又能够保证保存花粉的活力，进而保证较高的结实率，可实现一年收集多年受益的目的，对于保持甜樱桃产量的稳定、改善果实品质和提高经济效益具有重要意义。

附图说明

图1为本发明背景技术中不同甜樱桃品种在不同年份栽培的自然结实率统计。

图2为本发明实验例1中甜樱桃花朵经干燥粉碎后的图片；其中，a为采用实施例1的方法的甜樱桃花朵经干燥粉碎后的图片；b为采用实施例1的方法的甜樱桃花朵经干燥粉碎过筛后的图片；c为采用对比例1的方法的甜樱桃花朵经干燥粉碎后的图片。

图3为本发明实验例2中经超低温保存的花粉离体萌发率分析。

图4为本发明实验例3中经重复超低温保存的花粉活力分析。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1一种甜樱桃花粉快速收集和超低温保存方法(1)

本实施例提供一种甜樱桃花粉快速收集和超低温保存方法，具体步骤如下：

(1)花粉活力测定：

采集处于大气球期甜樱桃品种的花朵，在室内用不锈钢镊子剥离花药并用镊尖压碎花药，将花粉粒均匀涂在无菌的花粉萌发培养基上(萌发培养基的组分如下：12％蔗糖，0.015％硼酸，1％琼脂，121℃灭菌15分钟)，在25℃条件下培养24小时后在显微镜下观察统计花粉萌发率；选取花粉萌发率能够满足栽培要求的甜樱桃品种进行后续花粉收集和保存步骤；

(2)大气球期花朵采集及干燥预处理

于晴好天气上午8点，采集步骤(1)中选定的甜樱桃品种的大气球期花朵，将花朵平铺在托盘上并放入35℃恒温干燥箱内干燥预处理12小时；

(3)花粉收集

将花朵从恒温干燥箱中取出放入小型粉碎机，以20000转/分，粉碎2分钟，将粉碎物过30m筛，将花瓣等杂质过滤后收集花药；将花药在25℃干燥24小时，收集花粉；

(4)花粉超低温保存

将花粉(约0.5g)用硫酸纸包好，放入2ml冻存管中，直接投入液氮保存；

(5)花粉的快速化冻、使用和再次超低温保存

将液氮中保存的装有花粉的冻存管取出，快速投入25℃水浴中化冻3分钟，取出冻存管，用滤纸吸干水分后，取出花粉用于田间人工授粉。

实施例2一种甜樱桃花粉快速收集和超低温保存方法(2)

本实施例提供一种甜樱桃花粉快速收集和超低温保存方法，其与实施例1的区别仅在于：步骤(3)：将花朵从恒温干燥箱中取出放入小型粉碎机，以20000转/分，粉碎2分钟，将粉碎物过30m筛，将花瓣等杂质过滤后收集花药；将花药在35℃干燥12小时，收集花粉。

实施例3一种甜樱桃花粉快速收集和超低温保存方法(3)

本实施例提供一种甜樱桃花粉快速收集和超低温保存方法，其与实施例1的区别仅在于：步骤(5)：将液氮中保存的装有花粉的冻存管取出，快速投入25℃水浴中化冻2分钟，取出冻存管，用滤纸吸干水分后，取出花粉用于田间人工授粉。

实施例4一种甜樱桃花粉快速收集和超低温保存方法(4)

本实施例提供一种甜樱桃花粉快速收集和超低温保存方法，其与实施例1的区别仅在于：步骤(5)：将液氮中保存的装有花粉的冻存管取出，快速投入25℃水浴中化冻3分钟，取出冻存管，用滤纸吸干水分后，取出部分花粉进行萌发率检测或对栽培品种进行人工授粉，剩余部分花粉用硫酸纸包好后放入-20℃冰箱保存7天，将花粉放入冻存管再次直接投入液氮进行长期保存(第二次保存)。

对比例1

本对比例提供一种甜樱桃花粉收集和超低温保存方法，其与实施例1的区别仅在于：步骤(2)：于晴好天气上午8点，采集步骤(1)中选定的甜樱桃品种的大气球期花朵，将花朵平铺在托盘上并放入35℃恒温干燥箱内干燥预处理24小时。

对比例2

本对比例提供一种甜樱桃花粉收集和超低温保存方法，其与实施例1的区别仅在于：步骤(3)：将花朵从恒温干燥箱中取出放入小型粉碎机，以20000转/分，粉碎2分钟，将粉碎物过30m筛，将花瓣等杂质过滤后收集花药；将花药在24℃干燥48小时，收集花粉。

对比例3

本对比例提供一种甜樱桃花粉收集和超低温保存方法，其与实施例1的区别仅在于：步骤(3)：将花朵从恒温干燥箱中取出放入小型粉碎机，以20000转/分，粉碎2分钟，将粉碎物过30m筛，将花瓣等杂质过滤后收集花药；将花药在35℃干燥24小时，收集花粉。

实验例1花粉收集效率分析

本实验例以甜樱桃品种早大果为例，分别利用实施例1和对比例1的方法进行花粉收集和超低温保存，在步骤(3)将花朵从恒温干燥箱中取出放入小型粉碎机粉碎后，分析过筛分离情况，结果如图2所示，结果表明，利用实施例1的方法能够快速高效地去除杂质，分离得到纯度较高的花粉；而利用对比例1的方法，粉碎时花朵被打成粉末，难以通过过筛与花药分离，导致花粉的分离效率大大降低。

实验例2超低温保存的花粉活力分析

本实验例以甜樱桃品种早大果、玲珑脆、美早、红灯为例，利用实施例1～4和对比例2～3提供的方法进行甜樱桃花粉的收集和超低温保存，并分析超低温保存花粉的活力，具体如下：

针对早大果和美早两个甜樱桃品种，分别采用实施例1、实施例2、对比例2和对比例3的方法进行甜樱桃花粉的收集和超低温保存，利用离体萌发实验分析超低温保存花粉的活力，结果如图3所示，结果表明，采用实施例1和2的方法保存的花粉的萌发率显著高于采用对比例2和对比例3的方法。

针对早大果品种，利用实施例1的方法收集和超低温保存的甜樱桃花粉进行田间栽培实验，给栽培品种红灯进行授粉并套袋，一周后解袋，一个月后观察统计坐果率。结果表明，采用当年新鲜早大果花粉授粉结实率为49.8％，采用超低温保存后花粉授粉结实率为46.2％。利用实施例2和3的方法收集和超低温保存的甜樱桃花粉也能够达到与新鲜花粉相当的结实率，但实施例1的方法的结实率更优。

针对玲珑脆品种，利用实施例1的方法收集和超低温保存的甜樱桃花粉进行田间栽培实验，给栽培品种红灯进行授粉并套袋，一周后解袋，一个月后观察统计坐果率。结果表明，采用当年新鲜玲珑脆花粉授粉结实率为36.4％，采用超低温保存后花粉授粉结实率为42.1％。利用实施例2和3的方法收集和超低温保存的甜樱桃花粉也能够达到与新鲜花粉相当的结实率，但实施例1的方法的结实率更优。

针对美早品种，利用实施例1的方法收集和超低温保存的甜樱桃花粉进行田间栽培实验，给栽培品种玲珑脆进行授粉并套袋，一周后解袋，一个月后观察统计坐果率。结果表明，采用当年新鲜美早花粉授粉结实率为35.5％，采用超低温保存后花粉授粉结实率为33.4％。利用实施例2和3的方法收集和超低温保存的甜樱桃花粉也能够达到与新鲜花粉相当的结实率，但实施例1的方法的结实率更优。

实验例3重复超低温保存的花粉活力分析

针对红灯、早大果品种，利用上述实施例4的方法收集和超低温保存的甜樱桃花粉进行田间栽培实验，将在液氮中进行二次保存的装有花粉的冻存管取出，快速投入25℃温水中化冻3分钟，取出冻存管，用滤纸吸干水分后，取出花粉对栽培品种玲珑脆进行人工授粉。结果表明，在花粉收集前，检测萌发率(即实施例1的步骤1)分别为43.7％和51.6％；利用实施例4的方法对甜樱桃花粉进行二次超低温保存后，花粉的活力较第一次保存和新鲜花粉没有显著降低，经二次超低温保存的花粉仍能保持较高的活力(图4)。

虽然，在上文中已经一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之做成一些修改和改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。