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植物克隆技术的制作方法

花匠小妙招
2024-09-16 09:08

专利名称：植物克隆技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物培育技术，尤指一种植物克隆技术。
背景技术：
危害观赏植物的病毒有好几十种(见表1)，并且随着栽培时间的推移，危害越来越重，种类也越来越多。以种子进行繁殖的花卉，可随着世代的交替而去除病毒，病毒只能危害一代；而大多数观赏植物，尤其是木质观赏植物常常进行无性繁殖，病毒通过营养体进行传递，在母株内逐渐积累，危害就日趋严重。
表1 几种观赏植物上危害的主要病毒数

观赏植物受病毒危害时，表现为生长迟缓、花径变小、花色退化、品质变劣，大大降低观赏价值。
病毒与真菌和细菌不同，不能用化学药剂防治。因此无病毒苗的培育，已成为观赏植物中十分重要的一环。组织培养胶毒是一个积极有效的途径，通过脱除植株(严重患病毒的)的病毒，可以恢复种性，提高产量和品质。并且无污染，无公害，因而组织培养脱毒技术在生产实践中得到广泛应用。

发明内容
当花卉等植物材料在无琼脂的培养基中克隆时，称为液体克隆。悬浮细胞培养对于快速繁殖优良品种，尤其是引进的优良品种具有重要的意义。而最近发展的人工种子工程技术，尤其是用生物反应器进行悬浮细胞培养大量生产人工种子的技术，将引起植物种子繁殖的重大变革。从悬浮细胞克隆诱导胚胎发生技术的建立是人工种子工程的基础。此外，利用液体悬浮培养，在生物制药的研究和生产中具有重要作用。
液体克隆分静止克隆和振荡克隆两类。静止克隆一般要用滤纸支撑物，虽然在某些情况下(比如胚培养、无菌种子萌发)，滤纸支撑是比较理想的，但它并不能像半固体培养基那样提供一个根本变化的环境。尤其是营养仍然是通过外植体基部吸收的，这样就形成了一个梯度。然而把组织全部浸入液体培养基中，又出现一个通气问题。解决这一问题的方法是振荡克隆。在振荡克隆的情况下，便可以进行气体交换，同时消除了由于重力而引起的组织下沉现象以及营养、生长调节剂的梯度。
一、克隆方法1、液体浅层静止克隆这种方法是将一定密度的游离细胞悬浮液置于培养皿或特制的扁瓶中，在实验室内静止克隆。其优点是培养物与空气接触面积大，通气好，细胞的代谢产物也易于扩散，防止了有害物质的累积浓度过高而对培养物产生毒害，转移培养物或添加新鲜培养液也方便，并便于观察和照相。缺点是易造成悬浮在细胞培养液中的游离细胞局部密度过高或过低，有时也会出现密集的细胞在某一区域连成一片的现象，影细胞的分裂。
2、固体平板克隆这种方法是先将细胞悬浮于液体培养基中，而后与成分相同但含琼脂(事先融化好)的培养基等体积混合。冷却后培养基在培养皿中形成一平板，游离细胞埋于其中。它的优点是游离细胞在培养基中分布均匀，不会连成一片，并便于定点连续观察细胞的发育情况。而其缺点恰恰是液体浅层培养的优点，因此，游离细胞往往发育速度较慢。
3、周期性浸渍克隆在这一体系中，通过转床来摇动克隆瓶，使细胞交替地浸没和暴露于瓶内的空气中，保证了组织既可以很好的与培养基接触，又可进行适当的气体交换。外植体一般每隔10min便浸入培养基1min。常用的培养皿是圆试管(3.5cm×12.5cm)和三角瓶。还用一种奶头瓶，是侧面具有若干突起(“奶头”)的圆瓶，适合于较大容量的培养。在这种瓶内，培养基从试管一端流到另一端，或从奶头流出，从而产生搅动和通气效果。
4、连续浸渍克隆为了让组织或细胞不停地与培养基接触并保证通气良好，培养瓶需要不断振荡或搅动。台式振荡器可以达到这一效果。克隆瓶用夹子或橡皮底座固定，振荡速度变幅通常为30-400rpm(转/分)。但是一般来说，速度超过150rpm是不适合的。振荡的振幅一般为2-4cm。振荡器可安装在克隆室中，否则就要购置带有振荡器的克隆箱。此外还可应用往复式或回旋式水槽振荡器。
5、小量悬浮克隆表面玻璃可以作成小规模的培养皿，例如直径5cm的表面玻璃，放在密闭的培养皿中，用一圈湿棉花支撑，能够维持一潮湿的环境。适用于小量悬浮培养器皿是凹槽载玻片或用派热克斯玻璃制成的相应容器。
在液体克隆中，应用三种基本体系成批培养、半连续培养和连续培养。对于成批培养，培养基体积限定，当基本营养耗尽时细胞停止生长。在半连续培养中，定期排出原来培养基并注入新鲜培养基。连续培养有开放和密闭两种型式。在密闭式连续培养中，注入新鲜培养和排出的废旧培养基达到平衡。这一过程的控制有两种方法1、滴定法用注入限制细胞生长的一种或多种营养物质来调节细胞的生长速率。营养物质注入的速率取决于细胞加倍的时间，通常细胞加倍一次需25-35h。
2、浊度稳定法细胞数量的增长达到规定的临界值，培养物出现显著浑浊时，注入新鲜培养基。
二、胚状体的形态发生1、胚胎发生的方式在液体克隆中胚胎发生有两种方式，一种是从胚性细胞直接形成胚胎，这种细胞是胚胎发生之前已决定了的；另一种方式是已经分化的细胞首先脱分化，再经过愈伤组织的增殖，重新决定为胚性细胞，锻后分化形成胚胎。珠心细胞经增殖后形成胚性细胞团或愈伤组织，以后再次形成胚胎。已分化的细胞需要在人工培养中用细胞分裂素及生长素重新启动，进行有丝分裂，形成愈伤组织，然后再形成胚性细胞，因此，往往要经过相当长的一段时间的培养才能诱导出胚状体。通常是游离细胞在液体悬浮培养中，产生细胞团，进而变成胚性细胞复合体，再由胚性复合体的表面细胞产生胚状体。
2、胚状体形成的条件1、细胞与其周围组织之间的生理隔离是胚状形态发生的先决条件。如胚状体在开如发育时即可形成边缘细胞层，从而保持其相对的细胞独立。
2、适宜的激素水平。
3、细胞之间的相互作用是胚体发生的重要条件之一。平板培养时，直板的密度也是极为重要的因素，适宜的直板密度可以促进胚状体发生。
4、还原态氮(NH4+)是胚状体发生的重要营养条件。
5、材料生理状态与基因型的差异在一个植物种中不是所有材料均可以诱导出胚状体的，有些植物种或品种容易诱导，而有些则不诱导。
3、胚胎发生的同步性在离体培养下通过悬浮细胞克隆所形成的胚状体，其发育往往是不同步的，所以在同一悬浮培养液中可观察到单个原细胞、多细胞原胚、球型胚、鱼雷型胚，直至成熟的果子叶的胚状体。胚胎发育的同步性对于人工种子工程技术十分重要。为了建立人工种子工程技术，首先要建立大规模收集同步胚的分离程序。作为人工种子的胚应保持在发育的停阶段，以便在播种前能够贮存和运输，只有休眠的种子才便于保存在一个人工种子衣中，因此，人工种胚休眠的诱导也是研究课题之一。生长调节物质0.1-1.0mg/L，有的种类还需添加活性炭。
3、茎尖微芽嫁接脱毒一些木本植物采用茎尖培养往往难以生根，可利用微型嫁接法达到脱毒目的。具体操作是先将砧木种子进行表面消毒，接种在MS培养基上发芽，以苗龄2周的幼嫩实生苗作砧木。把实生苗从试管中取出，在无菌条件下切去顶部，留下1-1.5cm的上胚轴部分，将子叶和腋芽抹去，把根切短为4-6cm长。从旺盛生长的成年树上选取茎尖，在显微镜下切取仅带1-3个叶芽的茎尖，约1cm大小作为接穗。采用倒“T”字型按接法，在砧木胚轴上开口，沿茎下伸约1mm，水平切口宽约1mm，深达形成层。茎尖放在砧木的切口里，以其基部切面接触砧木的倒“T”字型的水平切口。嫁接苗用液体滤纸桥培养基培养。嫁接成活率在30％-50％。嫁接成功的植株移植到土壤之前至少要有2片展开的真叶。
三、脱毒方法1、热处理脱毒热处理之所以能去除病毒，主要是某些病毒受热以后去活性。热处理的方法有两种，一种是有50℃的热水处理3-15min，适合木本植物休眠芽；另一种是以37-38℃的热风处理2-4周，这种方法对于大多数生着的植物较为适合。热得理空气温度应逐渐升高，然后达到所需温度，同时必须保持一定的湿度和光照。热得理只对那些球状病毒(如葡毒)有效，且球状病毒也不是所有皆可除去而对杆状病毒(如千日纸病毒)，则不起作用。
2、茎尖克隆脱毒茎尖克隆脱毒的依据是，病毒在感染植株上的分布不致，老叶片和成熟的组织或器官中病毒含量较高，而幼嫩的及未成熟的组织和器官中病毒含量较低，生长点(0.1-1.0mm区域)几乎不含病毒。这是由于病毒繁殖运输速度比茎尖胞生长速度慢的缘故。茎尖越小，脱除病毒效果越好；而茎培养的成活率则与茎尖的大小正相关。故一般切取0.2-0.5mm带1-2个叶原基的茎尖作为外植体。脱毒培养的茎尖都较小，所以分离难度大，操作技术要求高。应很好观察茎尖形态，切取分离应在解剖镜下进行，同时要保证有良好的分离工具。将植株预先在37-40℃的高温条件下热处理2周到4个月，然后再分离茎尖培养，脱毒效果更好。
试管微体嫁接是克隆与嫁接方法相结合，用以获得具有特殊观赏价值花卉和无病毒苗木的新技术。它是将0.1-0.2mm的接穗茎尖嫁接到由试管中培养出来的无菌实生砧木上，继续进行试管培养，愈合成为完整植株。
一、试管微体嫁接的意义和作用1、培育无病毒植株长期栽培的优良花卉品种宽容易感染病毒及其他病菌，而使花卉的观赏价值降低，为了保持其原由的观赏价值，就要脱除病毒(或真菌、细菌)。脱除病毒的效果与茎尖的大小密切相关，茎尖越小脱毒效果越好，直接克隆太小的茎尖又难以成活。而利用微体嫁接技术，则可以达到既脱毒又能提高成活率和适应性。
2、解决生根难的问题对于有些营养繁殖生根难的花卉种类或品种，比如白兰等，可以借助于试管微芽嫁接的方法，解决生根难的问题。
3、提高观赏价值将不同花色或株型的花卉幼芽嫁接到适应能力较强、根系发达的同种或近缘种的试管生苗上，集多个品种的优良特性于一身，可以大大提高花卉的观赏价值。
4、提早开花通过嫁接获得的花卉可以提早开花。主要是由于嫁接时选用的接穗取自成熟植株的缘故。
5、复壮进行几次连续反复离体微体嫁接，能够使带叶枝复壮，增强繁殖能力，从而可以使衰老的无性系进行大量无性繁殖，这对于一些珍稀名贵花卉具有重要的价值。
2、接穗从田间或盆栽生长旺盛的植株上，剪取茎尖，在显微镜或解剖镜下切割成0.5-1.0mm的生长点，表面消毒2-3min。
为了提高嫁接成活率，常常对接穗进行预处理。切下茎尖，放在试管中的滤纸上。滤纸预先用MS营养液浸润，溶液中含有一定浓度生长素和细胞分裂素。通过上述得理，改善了离体茎尖的生理状况，并导致了多叶茎枝的迅速发育，用玉米素进行得理时，可明显提高嫁接成活率。如果是脱毒培养，在切取茎尖之前，先对感病植株高温预处理，温度因植物种类而异，然后再剪取茎尖，表面消毒后嫁接。
3、嫁接在无菌条件下，先切去砧木的茎尖，用经过消毒的嫁接刀沿砧木茎纵切0.2-0.3mm，然后将消毒后的生长点嫁接在准备好的砧木上，使两者的形成层紧密相接。嫁时可在组织上滴源少许氧化剂，防止接穗氧化褐变。在接穗和砧木之间滴上一滴胶(也可以在胶中加入生长调节物质)，或者滴一滴细胞分裂素(ZT或BA)，均可大大改善接穗茎尖的营养条件，提高嫁接成活率。经一周左右，接穗和砧木均产生愈伤细织并完全愈合。
4、移栽嫁接后培养5-6周，接穗发育成具有4-6片叶的新稍，这时即可移入灭菌的珍珠岩中，浇灌MS营养液，并盖以烧杯或塑料薄膜保持湿度。以后根据城要浇水。移载后6天内，每天烧杯口从一边提高0.5cm，一周以后去掉烧杯。再过几天可将幼苗移入温室内经过消毒的土壤中，正常管理。移栽成活的关键是控制杂菌、保持营养充足、通风良好和适宜湿度。
嫁接成活率与茎尖大小和植物生长时期有关。切取的茎尖越大，嫁接成活率越高；在生长旺盛时期，剪取接穗嫁接成活率较高。
权利要求
1.一种植物克隆技术，其特征是它包括(1)、液体浅层静止克隆这种方法是将一定密度的游离细胞悬浮液置于培养皿或特制的扁瓶中，在实验室内静止克隆。其优点是培养物与空气接触面积大，通气好，细胞的代谢产物也易于扩散，防止了有害物质的累积浓度过高而对培养物产生毒害，转移培养物或添加新鲜培养液也方便，并便于观察和照相。缺点是易造成悬浮在细胞培养液中的游离细胞局部密度过高或过低，有时也会出现密集的细胞在某一区域连成一片的现象，影细胞的分裂。(2)、固体平板克隆这种方法是先将细胞悬浮于液体培养基中，而后与成分相同但含琼脂(事先融化好)的培养基等体积混合。冷却后培养基在培养皿中形成一平板，游离细胞埋于其中。它的优点是游离细胞在培养基中分布均匀，不会连成一片，并便于定点连续观察细胞的发育情况。而其缺点恰恰是液体浅层培养的优点，因此，游离细胞往往发育速度较慢。(3)、周期性浸渍克隆在这一体系中，通过转床来摇动克隆瓶，使细胞交替地浸没和暴露于瓶内的空气中，保证了组织既可以很好的与培养基接触，又可进行适当的气体交换。外植体一般每隔10min便浸入培养基1min。常用的培养皿是圆试管(3.5cm×12.5cm)和三角瓶。还用一种奶头瓶，是侧面具有若干突起(“奶头”)的圆瓶，适合于较大容量的培养。在这种瓶内，培养基从试管一端流到另一端，或从奶头流出，从而产生搅动和通气效果。(4)、连续浸渍克隆为了让组织或细胞不停地与培养基接触并保证通气良好，培养瓶需要不断振荡或搅动。台式振荡器可以达到这一效果。克隆瓶用夹子或橡皮底座固定，振荡速度变幅通常为30-400rpm(转/分)。但是一般来说，速度超过150rpm是不适合的。振荡的振幅一般为2-4cm。振荡器可安装在克隆室中，否则就要购置带有振荡器的克隆箱。此外还可应用往复式或回旋式水槽振荡器。(5)、小量悬浮克隆表面玻璃可以作成小规模的培养皿，例如直径5cm的表面玻璃，放在密闭的培养皿中，用一圈湿棉花支撑，能够维持一潮湿的环境。适用于小量悬浮培养器皿是凹槽载玻片或用派热克斯玻璃制成的相应容器。在液体克隆中，应用三种基本体系成批培养、半连续培养和连续培养。对于成批培养，培养基体积限定，当基本营养耗尽时细胞停止生长。在半连续培养中，定期排出原来培养基并注入新鲜培养基。连续培养有开放和密闭两种型式。在密闭式连续培养中，注入新鲜培养和排出的废旧培养基达到平衡。这一过程的控制有两种方法(1)、滴定法用注入限制细胞生长的一种或多种营养物质来调节细胞的生长速率。营养物质注入的速率取决于细胞加倍的时间，通常细胞加倍一次需25-35h。(2)、浊度稳定法细胞数量的增长达到规定的临界值，培养物出现显著浑浊时，注入新鲜培养基。
全文摘要
本发明公开一种植物克隆技术，包括液体浅层静止克隆、固定平板克隆、周期性浸渍克隆、连续浸渍克隆和小量悬浮克隆以及脱毒操作，可提高产量和品质，并且无污染无公害，可在生产实践中广泛应用。
文档编号A01H4/00GK1481673SQ0212967
公开日2004年3月17日申请日期2002年9月10日优先权日2002年9月10日
发明者凌义华申请人:凌义华