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一种防治南方根结线虫的复合微生物菌剂及制备方法

花匠小妙招
2025-01-05 14:34

1.本发明属于根结线虫防治领域，具体涉及一种防治南方根结线虫的复合微生物菌剂及制备方法。

背景技术：

2.根结线虫（meloidogyne）是一类植物寄生性线虫，具有种类多、分布广、致病性强、繁殖及传播速度快的特性，其寄主范围超过5500种，如蔬菜、果树、观赏植物、烟草及药材等，已成为设施农业生产中连作障碍及致病成灾的重要病原线虫之一。根结线虫中分布最广泛、危害最严重的４个种类包括：南方根结线虫（m. incognita）、北方根结线虫（m. hapla）、爪哇根结线虫（m. javanica）和花生根结线虫（m. arenaria）。近年来, 随着蔬菜种植面积的不断扩大，根结线虫病的发生也日益严重，特别是在设施栽培中，由于重茬种植，在不少老龄棚室，根结线虫病已发展成为一种毁灭性病害，给保护地蔬菜的发展和稳产带来了严重的制约。
3.目前,化学防治仍是植物寄生线虫病害最主要的防治措施,但化学杀线虫剂存在毒性大、残留高、成本高、易污染环境、环境相容性较差等诸多问题。虽然生物防治的效果可能没有化学农药那么有效、快速，但其具有稳定、经济、长效和相对安全的特点，起到了除害增产、保护生态平衡、减轻环境污染、降低成本等作用。目前发现，淡紫拟青霉有很强的寄生能力，是目前较有效的防治根结线虫的天敌真菌，但是单一的菌株很难对根结线虫进行有效杀灭，活性相对较低，没有发挥微生物在土壤根际的生态效应。
4.大量研究表明，与单菌剂相比，生防菌剂的组合施用对植物根结线虫的防治有着光明的前景，一些特定微生物的组合施用能够从多方面进行趋避或杀死线虫，减少线虫对植物根部的侵染，提高植物本身生长活力。微生物菌剂具有选择性强、安全、高效，不易产生抗性等特点，但是纯微生物菌剂存在对环境的适应性差，在土壤中无法长久定殖以及防效不稳定等问题。此外，由于根结线虫的虫卵抗逆性很强，已报道的纯微生物菌剂无法完全杀灭虫卵，导致菌剂使用过后一段时间，根结线虫病仍会爆发。

技术实现要素：

5.本发明之目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种可以克服现有的生防菌剂在防治南方根结线虫所存在的菌种和生防机制单一、对环境的适应性差、土壤中无法长久定殖、防效不稳定以及根结线虫病反复爆发等问题的一种防治南方根结线虫病的复合微生物菌剂及其制备方法。
6.本发明的防治南方根结线虫病的复合微生物菌剂，包括淡紫拟青霉（paecilomyces lilacinus）、哈茨木霉（trichoderma harzianum）、蜡样芽胞杆菌（bacillus cereus）和多粘类芽孢杆菌（bacillus polymyxa）。
7.优选，还含有酶解羽毛粉。
8.优选，所述的酶解羽毛粉是将羽毛蒸煮后烘干粉碎，将粉碎后的羽毛粉加入到水
中，先加入由角蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶以及氨基酸肽酶组成的复合酶酶解，再加入酸性蛋白酶酶解，酶解结束后，过滤未溶解的羽毛，喷雾干燥，得到酶解羽毛粉。
9.优选，是将淡紫拟青霉菌粉、哈茨木霉菌粉、蜡样芽胞杆菌粉以及多粘类芽孢杆菌菌粉按照质量比10~20:5~10:1~2:5~10的比例进行均匀混合，得到复合菌粉，将复合菌粉与酶解羽毛粉按照质量比10:1~3的比例进行均匀混合，得到复合微生物菌剂。
10.优选地，每克复合微生物菌剂中淡紫拟青霉的孢子个数为1.0
×
10
8-1.0
×
10
10
个、哈茨木霉的孢子个数为1.0
×
10
8-1.0
×
109个、蜡样芽胞杆菌的芽孢个数为1.0
×
10
8-1.0
×
109个、多粘类芽孢杆菌的芽孢个数为1.0
×
10
8-1.0
×
109个。
11.优选地，每克复合微生物菌剂中淡紫拟青霉的孢子个数为1.0
×
10
8-1.0
×
10
10
个、哈茨木霉的孢子个数为1.0
×
10
8-1.0
×
109个、蜡样芽胞杆菌的芽孢个数为1.0
×
10
8-1.0
×
109个、多粘类芽孢杆菌的芽孢个数为1.0
×
10
8-1.0
×
109个。
12.优选地，所述的淡紫拟青霉为淡紫拟青霉（paecilomyces lilacinus）m-1，该菌于2019年3月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），地址：中国广东省广州市广东省科学院微生物研究所，保藏编号为gdmcc no. 60596。所述的淡紫拟青霉（paecilomyces lilacinus）m-1是发明人从华南地区番茄根际线虫中分离获得。
13.优选地，所述的哈茨木霉（trichoderma harzianum）购买于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），菌种编号为gdmcc 3.442。
14.优选地，所述的蜡样芽胞杆菌（bacillus cereus）购买于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），菌种编号为gdmcc 1.2779。
15.优选地，所述的多粘类芽孢杆菌（bacillus polymyxa）购买于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），菌种编号为gdmcc 1.591。
16.本发明的第二个目的是提供一种防治南方根结线虫病的复合微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：将淡紫拟青霉菌粉、哈茨木霉菌粉、蜡样芽胞杆菌粉以及多粘类芽孢杆菌菌粉按照质量比10~20:5~10:1~2:5~10的比例进行均匀混合，得到复合菌粉，即为复合微生物菌剂。
17.优选，还添加有酶解羽毛粉，是将上述复合菌粉与酶解羽毛粉按照质量比10:1~3的比例进行均匀混合，得到复合微生物菌剂。
18.优选，所述的淡紫拟青霉菌粉的制备方法是：将淡紫拟青霉接种于固体发酵培养基中进行培养，培养结束后，在35-40℃下鼓风干燥，再将干燥后的物料进行粉碎，得到淡紫拟青霉菌粉。
19.优选，所述的哈茨木霉菌粉的制备方法是：将哈茨木霉接种于固体发酵培养基中培养，培养结束后，在35-40℃下鼓风干燥，再将干燥后的物料进行粉碎，得到哈茨木霉菌粉。
20.优选地，所述的固体发酵培养基为麸皮：玉米粉质量比为1:1，蔗糖添加量为质量分数5%，尿素添加量为质量分数0.1%，硫酸铵添加量为质量分数0.1%，料水质量比为1:0.67。
21.优选，所述的蜡样芽胞杆菌菌粉的制备方法是：将蜡样芽胞杆菌接种于lb液体培养基中培养，培养结束后，喷雾干燥得到蜡样芽孢杆菌菌粉。
22.优选，所述的多粘类芽孢杆菌菌粉的制备方法是：将多粘类芽孢杆菌接种lb液体培养基中，培养结束后，喷雾干燥得到多粘类芽孢杆菌菌粉。
23.优选，所述的酶解羽毛粉的制备方法是：将羽毛蒸煮后烘干粉碎，将粉碎后的羽毛粉加入到水中，先加入由角蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶以及氨基酸肽酶组成的复合酶酶解，再加入酸性蛋白酶酶解，酶解结束后，过滤未溶解的羽毛，喷雾干燥，得到酶解羽毛粉。本发明的第三个目的是提供上述复合微生物菌剂在防治南方根结线虫病中的应用。
24.本发明的有益效果：本发明从众多菌类中选择四种菌株，其杀线虫机理各不相同，能协同增效：淡紫拟青霉能代谢产生衍生物和几丁质酶，穿透线虫的卵壳、幼虫及雌虫虫体壁，菌丝体在其体内吸收营养，进行繁殖；哈茨木霉能与线虫卵囊接触，生防菌菌丝包围整个卵进行寄生，降低线虫卵的孵化率，同时诱导植物产生抗病性；蜡样芽胞杆菌能调节植物根系分泌物组成，导致一些分泌物质的含量增加，进而驱避南方根结线虫；多粘类芽孢杆菌不仅能产生触杀线虫活性物质，还可以产生多种小分子挥发性物质，对根结线虫2 龄幼虫具有触杀、熏杀、诱杀和趋避等多种控制方式。本发明提供的由四种菌株复配制成的复合菌粉对南方根结线虫病的防治率达到80%以上，显著优于单一菌粉对南方根结线虫病的防治效果。
25.本发明提供的复合微生物菌剂含有的酶解羽毛粉不仅能诱导淡紫拟青霉产生角蛋白酶，增强淡紫拟青霉对根结线虫的防治效果，同时实验表明，添加了酶解羽毛粉的复合微生物菌剂能防止根结线虫病的反复爆发，延长了菌剂的防效周期。
26.本发明提供的复合微生物菌剂不仅能防止南方根结线虫病害，还能为植物根系提供更多营养支持，促生根系生长。
具体实施方式
27.以下结合具体实施例进一步解释本发明，但不对本发明构成任何限定。以下实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。
28.以下实施例所用的菌株如下：淡紫拟青霉（paecilomyces lilacinus）m-1，该菌于2019年3月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），地址：中国广东省广州市广东省微生物研究所，保藏编号为gdmcc no. 60596，该菌株公开于cn202110861550.2，发明名称：一株淡紫拟青霉m-1及其应用中。淡紫拟青霉（paecilomyces lilacinus）m-1是发明人从华南地区番茄根际线虫中分离获得。
29.哈茨木霉（trichoderma harzianum）购买于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），菌种编号为gdmcc 3.442。
30.蜡样芽胞杆菌（bacillus cereus）购买于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），菌种编号为gdmcc 1.2779。
31.多粘类芽孢杆菌（bacillus polymyxa）购买于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），菌种编号为gdmcc 1.591。
32.实施例1
一种防治南方根结线虫病的复合微生物菌剂的制备方法，该复合微生物菌剂包括淡紫拟青霉（paecilomyces lilacinus）m-1菌粉、哈茨木霉（trichoderma harzianum）菌粉、蜡样芽胞杆菌（bacillus cereus）菌粉、多粘类芽孢杆菌（bacillus polymyxa）菌粉以及酶解羽毛粉，具体制备步骤如下：（1）淡紫拟青霉m-1菌粉制备：将淡紫拟青霉m-1斜面菌种接种到pda平板上划线，28℃生化培养箱中培养72h，待长出单菌落后，将活化的淡紫拟青霉m-1接种于pda液体培养基，置于28℃，180rpm的恒温振荡器中培养72h，得到种子液，以质量比5%的接种量将种子液接种于装有2kg的固体发酵培养基的曲盘中，置于28℃的无菌培养室中培养7d，培养结束后，在35-40℃下鼓风干燥24-48h，再将干燥后的物料进行粉碎，得到淡紫拟青霉菌粉。
33.（2）哈茨木霉gdmcc 3.442菌粉制备：将哈茨木霉gdmcc 3.442斜面菌种接种到pda平板上划线，28℃生化培养箱中培养72h，待长出单菌落后，将活化的哈茨木霉gdmcc 3.442接种于pda液体培养基，置于28℃，180rpm的恒温振荡器中培养78h，得到种子液，以质量比5%的接种量将种子液接种于装有2kg的固体发酵培养基的曲盘中，置于28℃的无菌培养室中培养7d，培养结束后，在35-40℃下鼓风干燥24-48h，再将干燥后的物料进行粉碎，得到哈茨木霉菌粉。
34.（3）蜡样芽胞杆菌gdmcc 1.2779菌粉制备：将蜡样芽胞杆菌gdmcc 1.2779斜面菌种接种到lb平板上划线，30℃生化培养箱中培养16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有50ml的lb培养液的250ml 三角瓶中，置于30℃，200rpm的摇床中培养，制成种子液；以质量比1%的接种量将种子液接种于100l全自动发酵罐中，发酵罐的装液量为70%，发酵培养基为lb液体培养基，30℃，280rpm培养48h，培养结束后，在入口温度为160℃的喷雾干燥塔中进行喷雾干燥，得到蜡样芽孢杆菌菌粉。
35.（4）多粘类芽孢杆菌gdmcc 1.591菌粉制备：将多粘类芽孢杆菌gdmcc 1.591斜面菌种接种到lb平板上划线，37℃生化培养箱中培养16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有50ml的lb培养液的250ml 三角瓶中，置于37℃，250rpm的摇床中培养，制成种子液；以质量比1%的接种量将种子液接种于100l全自动发酵罐中，发酵罐的装液量为70%，发酵培养基为lb液体培养基，30℃，300rpm培养48h，培养结束后，在入口温度为160℃的喷雾干燥塔中进行喷雾干燥，得到多粘类芽孢杆菌菌粉。
36.（5）酶解羽毛粉制备：将家禽羽毛121℃高温蒸煮30min后烘干，然后粉碎碾磨过1mm孔径筛，再将过筛预处理的羽毛粉与水按质量比3:10进行混合，调节ph为9.0，将复合酶（按酶活比，由角蛋白酶45%、碱性蛋白酶10%、中性蛋白酶10%以及氨基酸肽酶35%组成）按6000u/g 羽毛的比例加入其中，混合均匀后，180rpm，53℃恒温酶解36h，再按2000 u/g 羽毛的比例加入酸性蛋白酶， 180rpm，40℃恒温酶解12h。酶解结束后，用双层纱布过滤未溶解的羽毛，在入口温度为170℃的喷雾干燥塔中进行喷雾干燥，得到酶解羽毛粉。按质量分数计，酶解羽毛粉游离氨基酸含量为33.75%，小肽含量为31.2%，水分含量5.34%。
37.所述家禽羽毛为鸡羽毛；角蛋白酶，广东博沃特生物科技有限公司生产；碱性蛋白酶，中性蛋白酶，酸性蛋白酶，河南仰韶生化工程有限公司提供；氨基酸肽酶，安琪酵母股份有限公司提供。
38.（6）复合微生物菌剂制备：将淡紫拟青霉菌粉、哈茨木霉菌粉、蜡样芽胞杆菌粉以及多粘类芽孢杆菌粉按照质量比10~20:5~10:1~2:5~10的比例进行均匀混合，得到复合菌
粉，将复合菌粉与酶解羽毛粉按照质量比10:1~3的比例进行均匀混合，得到复合微生物菌剂。每克复合微生物菌剂中淡紫拟青霉的孢子个数为1.0
×
10
8-1.0
×
10
10
个、哈茨木霉的孢子个数为1.0
×
10
8-1.0
×
109个、蜡样芽胞杆菌的芽孢个数为1.0
×
10
8-1.0
×
109个、多粘类芽孢杆菌的芽孢个数为1.0
×
10
8-1.0
×
109个。
39.供实施例2、3测试的复合微生物菌剂是将淡紫拟青霉菌粉、哈茨木霉菌粉、蜡样芽胞杆菌粉以及多粘类芽孢杆菌粉按照质量比20:5:1:5的比例进行均匀混合，得到复合菌粉，将复合菌粉与酶解羽毛粉按照质量比10:2的比例进行均匀混合。
40.步骤（1）和步骤（2）中所述的固体发酵培养基为麸皮：玉米粉质量比为1:1，蔗糖添加量为质量分数5%，尿素添加量为质量分数0.1%，硫酸铵添加量为质量分数0.1%。料水质量比为1:0.67。具体是将麸皮：玉米粉混合，然后添加蔗糖、尿素、硫酸铵，混合均匀后，再加水，搅拌均匀，制得固体发酵培养基，再经灭菌消毒。
41.实施例2实施例1的复合微生物菌剂对南方根结线虫致死率的测定（1）卵囊收集取根结线虫发病区植物根于解剖镜下挑取大小较一致的卵囊，用1%的次氯酸钠表面消毒3-4min，无菌水漂洗4-5次，备用。
42.（2）根结线虫二龄幼虫收集取处理后的卵囊，置于培养皿，皿底垫湿润滤纸1张，置于26℃培养箱中黑暗培养，5-7天后带卵囊孵化产生大量的二龄幼虫时，收集根结线虫备用。
43.（3）设置制剂组别应用实施例1制备的复合微生物菌剂、淡紫拟青霉菌粉、哈茨木霉菌粉、蜡样芽胞杆菌粉、多粘类芽孢杆菌粉、酶解羽毛粉、不添加酶解羽毛粉的复合微生物菌剂（即复合菌粉）进行试验。
44.实验组为复合微生物菌剂；对照组1：淡紫拟青霉菌粉；对照组2：哈茨木霉菌粉；对照组3：蜡样芽胞杆菌粉；对照组4：多粘类芽孢杆菌粉；对照组5：酶解羽毛粉；对照组6：不添加酶解羽毛粉的复合微生物菌剂。
45.（4）制剂预处理首先将所有组制剂进行活化，分别取1g制剂加入到10ml无菌水里面，28℃，180rpm振荡摇匀30min，制备成悬液。
46.（5）制剂对南方根结线虫致死率的测定取收集到的二龄根结线虫，用无菌水稀释至100条/ml。采用12孔板，每孔各加入活化好的制剂悬液1ml，然后加入含根结线虫的虫悬液1ml。以1ml无菌水加入1ml含有根结线虫的虫悬液作为对照。放置于28℃培养箱中黑暗培养。72h后于室温条件下以解剖镜观察线虫的死亡数及线虫总数（虫体僵直，以解剖针触及任不活动者为死亡），计算死亡率。每个处理设置4个重复。具体实验结果见表1：死亡率=（线虫死亡数/线虫总数）*100%相对致死率=死亡率-空白组死亡率
（6）结果与讨论由表1可知，四种微生物单菌剂对南方根结线虫均有致死效果，其中单菌剂中以淡紫拟青霉的杀线效果最好，对南方根结线虫的致死率能达到82.23%。将四种微生物单菌剂进行配伍得到的对照组6对根结线虫的致死率显著高于四种单独菌剂，体现出协同增效的生防功效。而在对照组6的基础上复配了酶解羽毛粉的实验组（复合微生物菌剂）对南方根结线虫的致死率有进一步的提升，达到94.34%，是所有组别中对南方根结线虫致死率最高的。单独的酶解羽毛粉对南方根结线虫还有一定的促生效果，没有致死效果，但是和四种微生物菌剂组合到一起却起到协同增效。
47.实施例3不同制剂对南方根结线虫病的防治防治效果的盆栽实验（1）材料与方法1）供试根结线虫及病土南方根结线虫、病土采集于惠州市博罗县番茄种植基地（根结线虫病害严重），将病根切碎联通病土混匀，备用。
48.2）实验方法采用盆栽试验，将病土装入直径25cm、高28cm的花盆中，采用珍珠岩育苗，移栽4叶龄番茄苗，每盆3株苗，采用三角形分布栽培；定植后第3天，将0.5g不同菌剂分别加入50ml无菌水中，充分振荡摇匀后，在植株周围进行施用（每株使用0.5g菌剂），共设7个处理。每个处理4次重复，每个重复一个盆栽。统一按照日常水肥管理方式进行。
49.应用实施例1制备的复合微生物菌剂、淡紫拟青霉菌粉、哈茨木霉菌粉、蜡样芽胞杆菌粉、多粘类芽孢杆菌粉、不添加酶解羽毛粉的复合微生物菌剂（即复合菌粉）进行试验。实验总共7个处理，实验组：0.5g复合微生物菌剂+50ml无菌水；对照组1：0.5g淡紫拟青霉菌粉+50ml无菌水；对照组2：0.5g哈茨木霉菌粉+50ml无菌水；对照组3：0.5g蜡样芽孢杆菌粉+50ml无菌水；对照组4：0.5g多粘类芽孢杆菌粉+50ml无菌水；对照组5：0.5g不添加酶解羽毛粉的复合微生物菌剂+50ml无菌水；空白组：50ml无菌水。
50.3）土壤根结线虫调查每盆盆栽于菌剂处理前、处理后第35天、处理后第70天对盆栽土进行取样，取根际
土壤100 g，用改良贝尔曼漏斗法分离线虫。用小玻璃瓶收集线虫液，静置2 h后，吸出2/3上清液，加入100 ℃开水杀死线虫。用体式显微镜观察，计数。计算虫口减退率及防治效果，公式如下：虫口减退率=（处理前虫口数-处理后虫口数）/处理前虫口数*100%虫口防治效果=（处理虫口减退率-对照虫口减退率）/（1-对照虫口减退率）*100%4）番茄根结指数调查挖出全部根系，调查根系收侵染程度，计算根结指数和防治效果，根结分级标准参照如下标准划分为0~5级。
51.分级标准如下：0级，根系上无根结；1级，根系1~5个根结；2级，根系上6~15个根结；3级，根系上16~30个根结；4级，根系上31~50个根结；5级，根系上50个以上根结。
52.计算公式如下：根结指数=∑（各级植株数
×
级数）/（调查总株数
×
5）
×
100；根结防治效果=（对照根结指数-处理根结指数）对照根结指数
×
100（2）结果与讨论1）不同制剂处理对南方根结线虫的防治效果由表2统计结果可知，复合微生物菌剂和单菌剂处理后第35天、70天，土壤中虫口减退率均显著高于空白组，对于线虫防效效果较好。菌剂处理35天，实验组和对照组中，虫口减退率均达到40%以上，防治效果达到60%以上，其中以微生物菌剂处理效果最好，虫口减退率达到77.48%，防治效果达到83.26%。但实验组（复合微生物菌剂）处理与对照组5（不添加酶解羽毛粉的复合微生物菌剂）处理在虫口减退率和虫口防治效果无显著差别。
53.菌剂处理70天，实验组和空白组中线虫数相比菌剂处理35天显著增加，其中单菌
剂处理以及不添加酶解羽毛粉的复合微生物菌剂处理在70天时，虫口减退率均显著降低。分析原因可能是土壤中根结线虫卵缓慢孵化，导致土壤中根结线虫增加，而微生物单菌剂和不添加酶解羽毛粉的复合微生物菌剂随着施用时间的增长，微生物在土壤中衰亡，防治效果变差，从而导致土壤中线虫虫口数增加。而复合微生物菌剂虫减退率未发生明显变化，为76.17%，其中线虫防治效果还有略微增加，达到85.67%。分析原因为：酶解羽毛粉含有游离氨基酸和多肽，能促进线虫卵的孵化，使土壤中的线虫卵全部被孵化出来，防止菌剂药效过后，线虫卵的孵化导致线虫病害的重新爆发；此外，酶解羽毛粉含有角蛋白，能诱导淡紫拟青霉产生角蛋白酶，增强对线虫的寄生效果；另外，酶解羽毛粉含有的营养物质能为微生物在土壤中的定殖提供营养，增加其生防长效性。
54.2）不同制剂处理对番茄根结指数的影响及防治效果由表3可知，复合微生物菌剂和单菌剂处理对番茄根结指数及防治效果有明显的影响。6组处理中番茄根结指数较空白组显著降低，其中以复合微生物菌剂处理根结指数最低，为12.65%，多粘类芽孢杆菌处理较高，为34.75%。由表3可知，复合微生物菌剂处理根结防治最好，达到80.33%。
55.实施例4：将实施例1的淡紫拟青霉菌粉、哈茨木霉菌粉、蜡样芽胞杆菌粉以及多粘类芽孢杆菌粉按照质量比10:10:1:10的比例进行均匀混合，得到复合菌粉，将复合菌粉与实施例1的酶解羽毛粉按照质量比10:1的比例进行均匀混合，得到复合微生物菌剂。
56.实施例5：将实施例1的淡紫拟青霉菌粉、哈茨木霉菌粉、蜡样芽胞杆菌粉以及多粘类芽孢杆菌粉按照质量比20:5:2:5的比例进行均匀混合，得到复合菌粉，将复合菌粉与实施例1的酶解羽毛粉按照质量比10:3的比例进行均匀混合，得到复合微生物菌剂。
57.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施内容方式不收上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、代替、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。