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一种北方根结线虫lamp快速检测方法及应用的制作方法

花匠小妙招
2025-01-05 14:53

专利名称：一种北方根结线虫lamp快速检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及北方根结线虫LAMP快速检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
根结线虫(Meloidogyne spp.)属植物根系专性内寄生线虫，是世界性分布的威胁全球农业生产的重要植物病原线虫之一。迄今己记载的根结线虫有90余种，其中南方根结线虫(M. incognita)、爪睡根结线虫(M. javanica)和花生根结线虫(M. arenaria)和北方根结线虫(M.hapla)是四种常见最重要的根结线虫。在我国，这四种根结线虫在大多数省(区)均有发生，侵染农作物达百种以上，致使寄主常年减产15 25%，有时达70%以上(徐建华，魏大为，詹裕定和程瑚瑞.江苏省大棚蔬菜寄生线虫的种类和发生.南京农业大学学报，1994，17 (I) :47-51).，严重地制约了大棚蔬菜、果树、花卉等作物的生产和出口创汇。据估计，我国农作物的生产每年因根结线虫的为害而遭受的经济损失达数亿元以上。据调查研究，我国分布最广泛、最常见的根结线虫与世界各地类似，包括南方根结线虫(M. incognita)、爪睡根结线虫(M. javanica)、花生根结线虫(M. arenaria)和北方根结线虫(M. hap I a)。北方根结线虫是1949年 Chitwood 在太平洋地区的咖啡树上发现的(Chitwood, B. G. 1949. Root-knot nematodes. Part-I. A revision of the genus Meloidogyne Goeldi，1887. Proceedings of the Helminthological Society of Washington 16 90-104.)。根结线虫的传统鉴定方法主要根据形态学，主要是根据会阴花纹进行鉴定，但由于不同地理种群之间存在较大的变异性导致有时结果不够准确。再者形态特征细微复杂，对专业知识要求高，鉴定过程耗时、费力，且需要大量线虫样本，在单头线虫水平上不能达到要求。后来发展的同工酶技术能快速准确的鉴定不同的根结线虫，但是它需要有适宜雌虫的存在，因而不适用于多数情况下幼虫和卵的检测。由于形态学和同工酶技术的局限性，上世纪90年代起开始了根结线虫分子鉴定的研究。目前针对根结线虫的PCR诊断法主要基于rDNA的ITS和IGS序列的rDNA-PCR法，基于 mtDNA 的 mtDNA-PCR-RFLP 法，基于 RAPD 的 SCAR-PCR 法。真核生物的rDNA在基因组内是以串联重复序列的形式出现,每一串联重复序列包括 3 个编码区(18SrRNA，5. 8SRNA，28SRNA)和两个 ITS (Internal Transcribed Spacers) 区，两个串联重复序列之间各一段IGS(Intergenetic Spaces)区。ITS是随后发展起来的全新分子标记，其优点在于拷贝数多，同时包含保守和变异序列，根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增。Zi jlstra等(Zijlstra,C. ,Lever,A. Ε. Μ. ,Uenk,B. J. and Sifhout, C. H. Differences between ITS regions of isolates of root-knot nematode Meloidogyne hapIa and M. chitwoodi. Phytopathology, 1995,85 1231-1237. Zijlstra, C. ,Uenk,B. J. and Sifhout,C. H. A reliable,precise method to differentiate species of root-knot nematode in mixtures on the basis of ITS-RFLPs. Fundamental andApplied Nematology. 1997，20 :59-63.)分析了 Μ· hap I a 和 M. chitwoodi ITS 区的差异进行了 ITS-PCR-RFLP分析，发现用Aui I. Dra I、HinfI可将二者分开，并且还能将二者与 M. incognita 和 M. javanica 分开。Pertersen 等(Petersen，D. J.，Vrain, T. C. Rapid identification of Meloidogyne chitwoodi，M. hapla，and M.fallax using PCR primers to amplify thei ribosomal intergenic spacer. Fundamental and Applied Nematology. 1996，19 (6) :601_605·)使用 PCR 引物扩增 M. chitwoodi、M. hapla 和 M. fallax 的ITS区，实现了对3种根结线虫的快速鉴定。Pertersen等(Pertersen，D. J.，Zi jlstra， C.，Wishart，J.，Blok, V. and Vrain，T.C. Specific probes efficiently distinguish root-knot nematode species using signature sequences in the ribosomal intergenic spacer. Fundamental and Applied Nematology，1997，20 :619_626.)根据 IGS区的差异，设计了 5条PCR引物，应用multiplex-PCR同时实现了对M. chitwoodi、 M. fallax和M. hapla的鉴定，其灵敏度可达单条幼虫。然而Powers等(Power,T. O. ,Todd, T. C.，Burnell，A. M.，Murray, P. C. B.，Fleming，C. C.，Szalanski，A. L，Adams，B. A.，and Harris， T， S.The rDNA internal transcribed spacer region as a taxonomic marker for nematodes. Journal of Nematology. 1997,29(4) :441_450.)发现 Μ· incognita、 M. javanica和M. arenaria ITS序列一致，Hugall 等(HugalI, A.，Stanton，J. , and Moritz, C. Reticulate evolution and the origins of ribosomal internal transcribed spacer diversity in apomictic Meloidogyne. Molecular and Biological Evolution. 1999，16: 157-164.)通过序列分析发现3种多倍体的主要根结线虫(M. incognita、M. javanica和 M. arenaria) ITS区遗传变异较大，因此基于ri)NA的鉴别方法无法有效区分主要根结线虫种群。RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)，是由 Wiliamson 等(Williams， J. G.，Kubelik，A. R.，Livak，K. J.，Rafalski，J. A.，and Tingey, S. V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Reaseareh. 1990,18 (22) :6531_6535.)和 Welsh 等(Welsh, J.，McClelland， M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Reaseareh. 1990,18(24) :7213_7218.)几乎同时发明的，RAH)依赖一系列不同的随机排列的寡核苷酸作为引物，对所研究的基因组DNA进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，经EB染色检测扩增产物的多态性。近年来，SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)技术的得到了广泛应用。Wiliamson 等(Williamson，V. Μ.，Caswel 1-Chen，Ε· P.，Westerdahl，B. B.，Wu，F. F.， and Caryl, G. Assay to Identify and Distinguish Single Juveniles of Meloidogyne hapla and M. chitwoodi. Journal of Nematology,29(I) 9-15.)通过对 M. chitwoodi 和M. hapla基因组DNA的RAPD分析，筛选出具有M. hapla种鉴定特征的特异性片段，经克隆测序后，设计了一对特异性引物，准确鉴定了 M. hapla ；Zi jlstra等(Zi jlstra，C.， Donkers-Venne, D.T.H.Μ. and Fargette, Μ.Identification of Meloidogyne incognita， M.javanica and M. arenaria using sequence characterized amplified region(SCAR) based PCR assays. Nematology，2000，2 :847_853)根据 Μ· incognita、Μ· javanica 和 M. arenaria 3种根结线虫的RAPD标记，设计了 3对SCAR引物，快速、准确的鉴定了这3种线虫；Zijlstra等(Zijlstra,C. ,Donkers-Venne,D. T. H. M. and Fargette,M. Identification of Meloidogyne incognita,M. javanica and M. arenaria using sequence characterized amplified region (SCAR) based PCR assays. Nematology, 2000, 2 847~853)利用 SCAR-PCR 同样鉴定了 M. chitwoodi> M. fallax 和 M. hapla。以PCR为基础的分子鉴定方法一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷。但PCR 检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，以上检测只能在实验室条件下才可以检测，需要较长的时间，限制了 PCR检测方法在生产中的推广应用。环介导恒温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是日本学者 Notomi (Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa Τ, Watanabe K, Amino N, Hase Τ. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research,2000, 28 e63.)发明的一种新式恒温核酸扩增技术。反应采用能特异识别靶序列上6个位点的 4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNA polymerase),在等温条件下(65°C 左右)可以高效(30min 60min)、高特异的扩增目标DNA。在LAMP反应过程中，从dNTPs 中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，能产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就判定扩增结果，也可通过向其扩增产物中添加荧光染料通过变化来判定结果，也可通过琼脂糖凝胶电泳进行观察可以看到梯形条带，尤其适宜于基层的简洁快速检测。LAMP反应具有简单、快速、高效、经济等特征。因而具有极为广泛的应用前景目前，LAMP在动物疫病和食品安全方面广泛应用，国内最早报道是在2002年北京奶牛中心运用引进的LAMP法进行胚胎性别的检测。2009年日本Kikuchi (Kikuchi T， Aikawa T, Oeda Y, Karim N, Kanzaki N. A Rapid and Precise Diagnostic Method for Detecting the Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus by Loop-Mediated Isothermal Amplification. Nematology. 2009,12 1365-1369.)开发出松材线虫 LAMP 快速检测体系，能在I小时内检测到松材线虫。2011年Niu等(Niu J H，Guo Q X，Jian H， Chen C L,Yang D,Liu Q,Guo Y D. Rapid detection of Meloidogyne spp. by LAMP assay in soil and roots. Crop Protection 2011,8,1063-1069.)根据 18s_rDNA_ITS 序列差异，开发出能检测根结线虫及特异性检测南方根结线虫的LAMP检测技术，2011年Niu等 (Niu, J. H. , Guo, Q. X. , Jian, H. , Chen, C. L. , Yang, D. , Liu, Q. , Guo, Y. D. Rapid detection of Meloidogyne spp. by LAMP assay in soil and roots. Crop Protection,2011,30 1063-1069.)根据根结线虫rDNA-IGS的序列差异，开发出象耳豆根结线虫LAMP检测技术。

发明内容
本发明的目的是采用环介导等温扩增技术(LAMP)建立检测北方根结线虫的LAMP 快速检测方法。一种北方根结线虫LAMP快速检测方法，以北方根结线虫DNA为模板，LAMP反应体系试剂中包括引物混合物、探针、反应缓冲液和反应酶，所述引物混合物有如下引物①MHF3 5，-GAATATGAGGTGACATGTTAGG-3，，②MHB3 5 ’ -TCAATGTTTCTGCAGTTCG-3 ’，③MHFIP : 5 ’ -TGAAAAAAATATTGCTGGCGTCCACCTTAATCGGGTTTAAGACT-3 ’，
④MHBIP :5 ’ -TCTATCCTTATCGGTGGATCACTCCACAAATTATCGCAGTTAGCT-3，，⑤MHLB 5，-GGCTCGTGGATCCATGAAGAACG—3，，所述方法还包括观察检测结果步骤，其特征在于在LAMP反应完的体系加入显色剂，观察显色情况。所述显色剂为SYBR green I。所述方法还包括观察检测结果步骤，其特征在于取LAMP扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳可观察到梯形带。所述方法还包括观察检测结果步骤，其特征在于引物混合物中MHFIP或MHBIP的 5’端带有生物素标记，在LAMP反应产物中加入FITC标记的探针，63°C保温5min，冷却到室温，取8 μ L的杂交液加入100 μ I PBS缓冲液，将LFD试纸浸入到杂交后的溶液中，通过观察 LFD 试纸上的条带，所述探针序列为MH-FITC-Probe :5’ -CTCGTGGATCCATGAAGAAC-3’， MH-FITC-Probe 的 5’ 端用 FITC 标记。所述引物混合液外引物MHF3和MHB3各O. 2 μ mol/L,内引物MHFIP和 MHBIP 各 I. 6 μ mol/L,环引物 MHLB 为 O. 4 μ mol/L,所述反应缓冲液6mmol/L dNTP, 20mmol/LTris-HCl(pH 8. 8),10mmol/L KCl,5mmol/L MgS04,lOmmol/L(NH4)2S04,0. I % Tritonx-100 ;反应酶8U Bst DNA聚合酶大片段。所述探针的浓度为20pmol/L。所述LAMP反应条件将引物混合液、反应缓冲液、反应酶混合均匀后加入I μ I DNA模板后，61 65°C保温30 60min，82°C保温5min。所述北方根结线虫DNA的提取试剂组分配方如下I) WLB 溶液500mmol/L KCl, 10mmol /T, Tris-HCl, 1 Smmol /T, MgCl2,1. Ommol /I, DTT, 4. 5% Tween20,等体积混勻，过滤灭菌；2)蛋白酶 K : 20mg/mL 蛋白酶 K。所述北方根结线虫DNA的提取方法为挑取单头根结线虫放入装有10 μ I ddH20 的O. 2mL离心管中，加入8 μ I的WLB溶液，2 μ I蛋白酶K溶液，放入液氮中，再放入37°C水浴锅中，待融化后放入液氮中，重复6 7次，然后在-80°C下冷冻30min ;将离心管转移到 65°C下温育90min，95°C反应IOmin处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。本发明利用环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)建立针对北方根结线虫的检测方法。本方法具有多条引物的扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于LAMP反应操作步骤简单及反应产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀，荧光剂显色后可以用肉眼观察判定反应结果，也可以用LFD试纸直接检测反应结果，适用于各种实验条件下检测工作的使用，也适合在实验条件不足的室外检测。本发明的方法具体实施方案I、线虫裂解液的配制I)WLB(Worm Lysis Buffer)溶液500mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/ LMgCl2,1. Ommol/L DTT, 4. 5% Tween20,等体积混勻，过滤灭菌。2)蛋白酶 K : 20mg/ml 蛋白酶 K。
2、线虫DNA的提取挑取单头北方根结线虫放入装有10 μ I ddH20的O. 2ml离心管中，加入8 μ I的WLB 溶液，2 μ I蛋白酶K溶液，放入液氮中，再放入37°C水浴锅中，待融后放入液氮中，重复6 7次，然后在-80°C下冷冻30min。然后将离心管取出，在65°C下温育90min，95°C反应IOmin 处理后作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。3、北方根结线虫rDNA-ITS扩增及序列分析采用ITS 区的通用引物 rDNA I (5，-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3 ’ )和 rDNA2 (5，-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’ )扩增两个北方根结线虫种群ITS区片段。PCR扩增反应体系为 50μ 1，PCR 反应体系为 IOXBuffer(含 Mg2+)5y 1，IOmM dNTP 4μ1，引物 rDNAl 和 rDNA2 (10 μ mol/L)各 I μ I, Taq 酶(5U/ μ I, Takara) O. 5 μ 1，模板 DNA 5 μ I,灭菌 ddH20 补足至50 μ I。PCR扩增条件为95°C预变性5min，55°C退火30sec，72°C延伸Imin ;94°C变性 45sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，35 个循环；72°C再次延伸 10min，4°C保存。PCR 扩增后，取5 μ I扩增产物加I μ I加样缓冲液在I. 5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相回收、克隆和测序，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。4、北方根结线虫LAMP引物设计根据北方根结线虫ITS测序结果为模板，设计以下5条引物和一条探针，序列如下①MHF3 5，-GAATATGAGGTGACATGTTAGG-3，②MHB3 5，-TCAATGTTTCTGCAGTTCG-3 ’③MHFIP :5’ -TGAAAAAAATATTGCTGGCGTCCACCTTAATCGGGTTTAAGACT-3’④MHBIP :5’ -TCTATCCTTATCGGTGGATCACTCCACAAATTATCGCAGTTAGCT-3’⑤MHLB 5，-GGCTCGTGGATCCATGAAGAACG-3，⑥MH-FITC-probe 5，-CTCGTGGATCCATGAAGAAC-3，LFD试纸检测时，使用5 !端生物素标记的MHFIP引物和5 !端用FITC标记 MH-FITC-Probe 探针。5、LAMP反应体系配制外引物MHF3和MHB3各O. 2 μ mol/L，内引物MHFIP和MHBIP 各 1.6“11101/1，环引物腿1^为0.4 4 11101/1，10臟01/1 dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)， I Ommol/L KCl,5mmol/L MgSO4, lOmmol/L (NH4) 2S04，0· I % Triton x_100，8U Bst DNA 聚合酶大片段，I μ I DNA模板，用灭菌双蒸馏水补全到25 μ I。6、LAMP反应体系扩增条件将以上反应成分加入反应管中混合后，置于60 65°C 恒温水浴中等温扩增30 60min,82°C保温5min。7、LAMP结果检测结果可以采用以下三种检测方法I)将上述反应完的体系中加入2μ I的显色剂。轻晃混匀，即可肉眼观察；2)取2 μ I扩增产物在2 %琼脂糖凝胶电泳中电泳可观察到梯形带；3)在反应产物中加入5 μ L FITC标记的MH-FITC-Probe探针，63°C保温5min，冷却到室温，取8 μ L的杂交液加入100 μ I PBS缓冲液，将LFD试纸浸入到杂交后的溶液中，通过观察LFD试纸上的条带即可得到结果。
本发明所提供的北方根结线虫LAMP快速检测方法具有以下优点一、灵敏度高，对北方根结线虫的检测极限可低至1/200 000头，检测灵敏度比常规PCR高100倍。二、特异性强，所用的特异引物根据北方根结线虫的ITS不同区域设计出5条引物，并与特异性探针结合，特异性比常规PCR要强。三、检测时间短，Ih左右可获得检测结果，比常规PCR检测节省2 4h。四、仪器设备要求低，不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个水浴锅就可以完成检测。五、操作简单、结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学学基础的人员即可完成。结果清晰明显，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察。六、对人和环境友好，检测过程不需要使用EB等有毒试剂，对人和环境非常安全。综上所述，本发明具有比现有PCR技术检测北方根结线虫的方法具有更高的特异性、灵敏度和便携性。可以在实际生产中现场应用检测。该技术可应用于对北方根结线虫田间土壤样品及植物上北方根结线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。

图I北方根结线虫ITS序列的LAMP引物和探针设计示意图，A为北方根结线虫LAMP引物和探针的位点，B为北方根结线虫LAMP引物设计示意图，图2北方根结线虫LAMP方法检测，A为加荧光染料检测结果，I :阳性结果，具有绿色荧光，2 :阴性对照，为深褐色。B 为检测结果为电泳图，M D2000DNA标准分子量(Takara) I :阳性结果，为LAMP扩增梯形条带，2:阴性对照，无扩增产物。C为LFD试纸检测结果图，I :阳性结果，有测试带和控制带，2 :阴性对照，只有控制带。图3北方根结线虫不同地理种群的LAMP检测结果A为加荧光染料检测结果，I =MHYJ, 2 =MHYN, 3 :阴性对照。B为电泳检测结果，M D2000DNA标准分子量(Takara)，I =MHYJ, 2 =MHYN, 3 阴性对照。C为LFD试纸检测结果，I =MHYJ, 2 =MHYN, 3 阴性对照。图4北方根结线虫LAMP方法特异性检测结果A为LAMP加荧光染料检测结果图，I 13分别为MHYJ、MIDX、MEXED、MJYN、MAYN、 RSAM、PLD、DdCL、GS-14、GS-11、BD、BX 和阴性对照。B为LAMP检测结果电泳图，M D2000DNA标准分子量(Takara)，I 13分别为 MHYJ, MIDX、MEXED, MJYN、MAYN、RSAM、PLD、DdCL, GS-14、GS-11、BD、BX 和阴性对照。图5北方根结线虫LAMP方法灵敏度检测结果A为LAMP加荧光染料检测结果图，I 8分别为单头线虫，10'10_2、10_3、10_4、 10_5、10_6和阴性对照。
B为LAMP检测结果电泳图，M D2000DNA标准分子量(Takara)，I 8分别为单头线虫，10—1、10_2、10_3、10_4、I O-5、10_6 和阴性对照。C为普通PCR法检测结果电泳图，M D2000DNA标准分子量(Takara)，I 8分别为单头线虫，10-1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6 和阴性对照。
具体实施例方式实验材料共收集2个北方根结线虫种群(MHYJ和MHYN)(见表I)。本实验室均有保存，可以对公众发放。表I供试北方根结线虫种群及其来源
权利要求
1.一种北方根结线虫LAMP快速检测方法，以北方根结线虫DNA为模板，LAMP反应体系试剂中包括引物混合物、反应缓冲液和反应酶，所述引物混合物有如下引物①MHF3 :5’ -GAATATGAGGTGACATGTTAGG-3’，②MHB3 :5’ -TCAATGTTTCTGCAGTTCG-3’，③MHFIP :5’ -TGAAAAAAATATTGCTGGCGTCCACCTTAATCGGGTTTAAGACT-3’，④MHBIP :5’ -TCTATCCTTATCGGTGGATCACTCCACAAATTATCGCAGTTAGCT-3’，⑤MHLB :5，-GGCTCGTGGATCCATGAAGAACG-3，。
2.根据权利要求I所述的检测方法，所述引物混合液为外引物MHF3和MHB3各O.2ymol/L,内引物 MHFIP 和 MHBIP 各 I. 6 μ mol/L，环引物 MHLB 为 O. 4ymol/L，所述反应缓冲液6mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl 的 pH 为 8· 8，10mmol/L KCl，5mmoI/LMgSO4, lOmmol/L (NH4) 2S04,0. 1% Triton x-100 ;反应酶8U Bst DNA 聚合酶大片段。
3.根据权利要求I或2所述的检测方法，还包括观察检测结果步骤，其特征在于在 LAMP反应完的体系加入显色剂，观察显色情况。
4.根据权利要求3所述的检测方法，所述显色剂为SYBRgreen I。
5.根据权利要求I或2所述的检测方法，还包括观察检测结果步骤，其特征在于取 LAMP扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳可观察到梯形带。
6.根据权利要求I或2所述的检测方法，还包括观察检测结果步骤，其特征在于引物混合物中MHFIP或MHBIP的5’端带有生物素标记，在LAMP反应产物中加入20pmol/L的 FITC标记的探针，63°C保温5min,冷却到室温，取8 μ L的杂交液加入100 μ I PBS缓冲液，将LFD试纸浸入到杂交后的溶液中，通过观察LFD试纸上的条带，所述探针序列为MH-FITC-Probe :5’-CTCGTGGATCCATGAAGAAC-3’，MH-FITC-Probe 的 5’端用 FITC 标记。
7.根据权利要求1-6任一所述的检测方法，所述LAMP反应条件将引物混合液、反应缓冲液、反应酶混合均匀后加入I μ I DNA模板后，61 65°C保温30 60min，82°C保温 5min。
8.根据权利要求I所述的检测方法，所述北方根结线虫DNA的提取试剂组分配方如下1)WLB溶液500mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/L MgCl2,1. Ommol/L DTT,4.5% Tween20,等体积混勻，过滤灭菌；2)蛋白酶K:20mg/mL蛋白酶K。
9.根据权利要求8所述的检测方法，所述北方根结线虫DNA的提取方法为挑取单头根结线虫放入装有10 μ IddH2O的O. 2mL离心管中，加入8μ I的WLB溶液，2 μ I蛋白酶K溶液，放入液氮中，再放入37°C水浴锅中，待融化后放入液氮中，重复6 7次，然后在_80°C 下冷冻30min ;将离心管转移到65°C下温育90min，95°C反应IOmin处理后上清液作为线虫 DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。
10.权利要求1-9所述任一检测方法在诊断植物、土壤的北方根结线虫感染情况或鉴别北方根结线虫中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种北方根结线虫LAMP快速检测方法及应用，属生物技术领域。本发明根据克隆测序的北方根结线虫ITS序列，在其序列保守区域设计了5条LAMP引物MHF3、MHB3、MHFIP、MHBIP和MHLB，探针MH-FITC-Probe5’端用FITC标记，其中MHFIP引物的5’端用生物素标记。通过对北方根结线虫DNA提取，采用上述特异性引物混合物、反应缓冲液和反应酶，等温扩增、扩增产物显色检测，从而快速检测出北方根结线虫。本发明的检测方法特异性强、灵敏度高、成本低廉、操作简便，灵敏度高，在北方根结线虫现场快速检测和北方根结线虫病的早期诊断方面具有很高的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK102586461SQ20121007092
公开日2012年7月18日申请日期2012年3月16日优先权日2012年3月16日
发明者何旭峰, 彭德良, 彭焕申请人:中国农业科学院植物保护研究所