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一种高效大规模鉴定大豆种质对传粉昆虫吸引力的方法与流程

花匠小妙招
2025-01-09 10:24

技术领域：

本发明提供一种高效大规模鉴定大豆种质对传粉昆虫吸引力的方法，涉及大豆不育系及任一可育大豆种质对传粉昆虫吸引能力的测定，利用这种方法选育高度吸引传粉昆虫大豆“三系”（指不育系，保持系和恢复系）亲本，达到昆虫高效传粉，提高杂交大豆制种产量的目的；属于作物杂交种选育及杂交种种子生产技术领域。

背景技术：
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中国已经成为全球消费和进口大豆最多的国家。然而，与玉米水稻等主要粮食作物相比，大豆单位面积产量相对较低。大豆有明显的杂种优势，大豆杂交种的应用推广也可大幅度提高大豆单产。目前中国大豆杂种优势研究处于国际领先地位，利用细胞质雄性不育“三系”选育并审定了世界上第一批大豆杂交种，且已在生产上推广种植。一般情况下，大豆杂交种可增产10%-20%。虽然杂交大豆的研发取得了突破性进展，但仍有一些关键问题制约大豆杂交种选育及杂交种种子生产，问题之一是制种产量低，而“三系”对传粉昆虫吸引力改良程度低是重要原因。

大豆是典型的自花授粉作物，常规品种自交结实，不需要任何形式的花粉传递，天然异交率很低，只有1%左右。而杂交大豆种子的生产则需要花粉从父本传到母本，所有杂交种百分之百都应该是异交的。人工授粉效率低，不可行。大豆花粉数量少，粘重，风煤传粉亦不可能。大豆虽然不是典型的虫媒花，但有虫媒花的结构，能在一定程度上吸引传粉昆虫。大豆杂交种的生产只能靠虫媒授粉。可为父母本传粉的昆虫主要是各种蜂类，如蜜蜂，苜蓿切叶蜂和各种野生蜂类。传粉昆虫访问大豆花的动机是取食花粉、花蜜、水分和其他营养物质。花粉和花蜜的数量、质量以及一些挥发物质都是决定对传粉昆虫吸引力的物质基础。然而，大豆花蜜分泌量相对较少，分泌时间短，开花后很快被昆虫取食，在不隔离的情况下，测量的结果不能完全反映实际的分泌量，最吸引昆虫的材料可能在第一时间花蜜被吸光，测量不及时反而会成为花蜜分泌最少的材料。同时，现有的测量方法（用微型毛细管取样）效率很低，无法在短时间内对大量植株进行测量。花蜜的质量，如浓度、各种糖的比例更不易准确测定。而花粉数量和质量的测定更难，每朵花的花粉数量多达数千粒，快速检测大量基因型很难做到，而昆虫对花粉的质量如何选择，尚不十分清楚。即使花粉和花蜜的数量和质量与对昆虫的吸引力和异交率有一定相关，但仍然是间接的，究竟花粉、花蜜、挥发物还是其他未知物质哪一项与吸引昆虫相关最密切尚无定论。大豆开花期持续近一个月，无法对上述物质多次测量，仅凭一次或几次瞬时测量结果，反映不出整个开花期的实际情况。

目前在大豆“三系”选育过程中，首先是对新种质进行测交确定恢、保关系，直到育成稳定“三系”，不进行“三系”对昆虫吸引力的测定。用这些“三系”育成杂交种并开始生产杂交种种子时，一旦发现不育系和（或）恢复系不吸引昆虫，整个杂交种和相应的三系就会被淘汰，前功尽弃。在大豆杂交种选育的高级阶段，大量淘汰已经育成的“三系”和杂交种，极大地降低了大豆杂交种的选育效率，增加了选育过程的盲目性和被动性。浪费大量人力、物力和时间。如何在测交前就明确育种材料对昆虫的吸引力，如何高效选育高度吸引传粉昆虫的大豆“三系”亲本，是一个亟待解决的技术难题，此技术的解决，将极大地提高大豆“三系”选育和杂交种选育的效率，这正是本发明的出发点。

技术实现要素：
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本发明提供一种高效大规模鉴定大豆种质对传粉昆虫吸引力的方法，利用细胞质雄性不育系（以下简称不育系），高效大规模鉴定大豆种质对传粉昆虫吸引力的方法，可鉴定任何一份大豆不育系或可育种质对传粉昆虫吸引力的高低，解决了现有育种方法在选育优良大豆“三系”种质方面效率低的缺陷，具有省时、省力、方法简单、可操作性强、结果可靠、效率高等优点。

本发明所述的一种高效大规模鉴定大豆种质对传粉昆虫吸引力的方法，其特征在于：

在同一微型试验小区内不育系与其同型保持系或可育种质以多种特定种植方式相邻种植，不同微型试验小区播种不育系与其同型保持系或不同可育种质，设三次重复；开花期，通过吸引野生传粉昆虫不间断选择授粉，用不育系结荚率或结实数直接表示传粉昆虫完成授粉情况，不育系结荚多少，代表野生传粉昆虫在不育系及可育系间活动活跃程度，即为大豆种质对传粉昆虫吸引力的高低。测定不育系对传粉昆虫吸引力时，在鼓粒期至成熟期调查不育系及其同型保持系结荚数，并计算其结荚率，依据结荚率的高低鉴定获得不育系及其保持系昆虫吸引力的强弱，测定可育种质对传粉昆虫吸引力时，在鼓粒期至成熟期仅调查不育系结荚数，依据不同微型小区内不育系结荚数的高低鉴定获得对应可育种质对传粉昆虫吸引力的强弱。

所述的一种高效大规模鉴定大豆可育种质对传粉昆虫吸引力的方法，其特征在于：

以昆虫传粉结实性高的早熟、中熟或晚熟不育系为母本测验种，以早熟、中熟或晚熟被测种质为父本，测验种与被测种质在微型试验小区内以多种特定种植方式相邻种植，设三次重复，整个开花期，通过野生传粉昆虫不间断选择授粉，在鼓粒期至成熟期调查各小区母本测验种单株结荚数量，通过分析各小区测验种单株结荚数高低差异，确定被测种质对传粉昆虫吸引能力的高低，筛选出高度吸引传粉昆虫的大豆种质，进一步选育昆虫传粉结实性高的大豆恢复系、保持系及不育系。

所述的一种高效大规模鉴定大豆可育种质对传粉昆虫吸引力的方法，其特征在于微型试验小区内的4种特定种植方式；

a微型试验小区内，分2行种植，测验种与被测可育种质在同行上左右播种；

b微型试验小区内，分3行种植，分别为被测可育种质、测验种、被测可育种质；

c微型试验小区内，分2行种植，测验种与被测可育种质相间种植；

d微型试验小区内，分2行种植，测验种与被测可育种质等量混合后随机种植。

本发明一种高效大规模鉴定大豆可育种质对传粉昆虫吸引力的方法，包括以下步骤：

1）测验种的选择：鉴定可育大豆种质对传粉昆虫吸引力时，选择与被测可育种质熟期组相同、育性稳定、昆虫传粉结实性高的不育系做母本测验种，多个被测可育种质做父本；

2)试验地的选择：在干旱少雨，野生传粉昆虫较为丰富的地区，选择土壤肥力均匀，适合种植大豆，没有逆境因子的地块做鉴定用地；

3）田间种植方式：

鉴定可育大豆种质对传份昆虫的吸引力：试验采用随机区组设计，三次重复，在播种季节，在每个微型小区内，测验种与1份被测种质相邻种植，具体种植方式如下：

种植方式一：见图1，在鉴定可育种质时，图中a、♂分别代表同一测验种不育系及被测可育种质，下同；小区大小为1.3m×2.0m，相邻小区间距0.65-1.0m，小区内2行播种，行距0.60-0.65m，测验种与1份被测种质在行上左右相邻种植，二者间距10-30cm，测验种间或被测种质间穴距15-40cm，播种方式为穴播，播种量为每穴2-6粒，出苗后每穴定苗为1或2株；

种植方式二：见图2，小区大小为1.95m×2.0m，相邻小区间距0.65-1.0m，小区内3行播种，行距0.60-0.70m，第1、3行播种1份被测种质，第2行（中间行）播种测验种，播种方式为穴播，穴距15-40cm，播种量为每穴2-6粒，出苗后每穴定苗为1或2株；

种植方式三：见图3，小区大小为1.3m×2.0m，相邻小区间距0.65-1.0m，小区内2行播种，行距0.60-0.70m，测验种与1份被测种质在行上前后相间种植，播种方式为穴播，穴距15-40cm，播种量为每穴2-6粒，出苗后每穴定苗为1或2株；

种植方式四：见图4，小区大小为1.3m×2.0m，相邻小区间距0.65-1.0m，小区内2行播种，行距0.60-0.70m，测验种与1份被测种质种子等量混合后在行上播种，播种方式为穴播，穴距15-20cm，播种量为每穴2-6粒，出苗后每穴定苗为1或2株；

4）田间管理：

出苗后的田间管理同大豆生产田，开花前及时进行除草除虫，开花后禁止施用杀虫剂，避免对传粉昆虫造成危害，影响传粉及结实；

5）花粉育性检查：

在测验种和被测不育系开花期，根据不同种植方式下测验种或不育系的播种位置选取测验种进行花粉败育率检查，拔出可育植株，针对种植方式四，可依据测验种的表型遗传特征（花颜色，茸毛颜色，叶片形状）在田间选择不育系进行育性检查，同时标记不育株；

6）结荚数调查统计：

测验种鼓粒期至成熟期，在每个小区中间位置取样，每行连续取5穴或10株测验种不育系，调查结荚数，计算平均结荚数。以结荚数多少从高到底排序。这个排序也是对应的相邻种植的被测种质对传粉昆虫吸引力大小的排序，结荚多者即代表相邻种植的被测种质对传粉昆虫的吸引力强，反之则弱；

7）筛选获得高昆虫吸引力可育种质：

按既定选择压力，选出一定比例的高度吸引昆虫的被测可育大豆种质，供高异交率三系育种应用。

本发明公开的一种高效大规模鉴定大豆不育系对传粉昆虫吸引力的方法，其特征在于：

在同一微型试验小区内不育系与对应同型保持系以多种特定种植方式相邻种植，不同微型试验小区播种不同基因型的不育系及其同型保持系，设三次重复。整个开花期，通过野生传粉昆虫不间断选择授粉，在鼓粒期至成熟期调查不育系及对应同型保持系结荚数，计算其结荚率，统计分析不育系间结荚率高低差异，以此确定不育系及对应同型保持系吸引传粉昆虫的能力。

所述的一种高效大规模鉴定大豆不育系对传粉昆虫吸引力的方法，其特征在于微型试验小区内的3种特定种植方式：

a微型试验小区内，分2行种植，不育系与同型保持系在同行上左右播种；

b微型试验小区内，分3行种植，分别为同型保持系、不育系、同型保持系；

c微型试验小区内，分2行种植，每行上同型保持系与不育系相间种植；

所述的一种高效大规模鉴定大豆不育系对传粉昆虫吸引力的方法，包括以下步骤：

1）鉴定材料选择：鉴定材料为大豆不育系及其同型保持系；

2）试验地的选择：在干旱少雨，野生传粉昆虫较为丰富的地区，选择土壤肥力均匀，适合种植大豆，没有逆境因子的地块做鉴定用地；

3)试验设计：采用随机区组，三次重复，在播种季节，在田间微型试验小区内，不育系与其同型保持系相邻种植，具体种植方式如下：

种植方式一，见图1，在鉴定不育系时，图中a、♂分别代表不育系及同型保持系，下同；小区大小为1.3m×2.0m，相邻小区间距0.65-1.0m，小区内2行播种，行距0.60-0.70m，被测不育系与其同型保持系在行上左右相邻种植，间距5-30cm，被测不育系间或同型保持系间穴距10-40cm，播种方式为穴播，播种量为每穴2-6粒，出苗后每穴统一定苗为1或2株；

种植方式二：见图2，小区大小为1.95m×2.0m，相邻小区间距0.65-1.0m，小区内3行播种，行距0.60-0.70m，第1、3行播种被测不育系的同型保持系，第2行（中间行）播种被测不育系，播种方式为穴播，穴距10-40cm，播种量为每穴2-6粒，出苗后每穴定苗为1或2株；

种植方式三：见图3，小区大小为1.3m×2.0m，相邻小区间距0.65-1.0m，小区内2行播种，行距0.60-0.70m，被测不育系与同型保持系在同一行上前后相间种植，播种方式为穴播，穴距15-40cm，播种量为每穴2-6粒，出苗后每穴定苗为1或2株；

在不同生态区及不同耕作方式情况下，小区大小、播种行数、播种方式及播种密度，在满足材料能正常生长条件下，可适当调整；

4)试验地田间管理：

出苗后的田间管理同大豆生产田，开花前及时进行除草除虫，开花后禁止施用杀虫剂，避免对传粉昆虫造成危害，影响传粉及结实；

5）花粉育性检查：

在被测不育系开花期，根据不同种植方式不育系的播种位置选取不育系进行花粉败育率检查，拔出可育植株，种植方式三同时标记不育株；

6）结荚数调查统计：

在被测不育系及同型保持系鼓粒期至成熟期，在每个小区中间位置对被测不育系及同型保持系分别取样，每行连续取5穴或10株母本不育系和相同株数的同型保持系，调查结荚数，计算平均结荚数；以被测不育系与同型保持系平均结荚数的比值，计算被测不育系昆虫传粉结荚率；

7）获得高昆虫吸引力不育系：

对结荚率从高到低排序，按既定选择压力，选出一定比例的高度吸引昆虫的被测不育系，供杂交组合选育及杂交种生产应用。

本发明的积极效果在于：基于传粉昆虫的以下习性，传粉昆虫优先访问对其有吸引力的访问对象；传粉昆虫喜欢在邻近的访问对象间取食，如果被测种质和相邻的测验种吸引昆虫能力都强，则测验种被相邻的被测种质授粉的机会就多，结荚也相对较多。

摆脱了用测量某些与吸引传粉昆虫有关的物质，如花粉、花蜜等，间接反映对传粉昆虫的吸引力，而是直接用测验种结荚数的相对多少来判断和比较被测材料吸引昆虫能力的大小和强弱，最为直观，最为客观。避免了间接测定法中某些人为的、主观的因素，也避免了开花期无法经常、大量取样的缺点，直接以传粉昆虫本身在整个开花期每天不断地、多次重复地选择为依据，所得结果最为科学，最为准确，最为可靠。本发明操作简单。克服了其他方法操作复杂，需要特殊设备，特殊技能，效率低，易受环境和人力物力影响，不能大量测验被测材料的缺点。生育期间除不育系的育性检查外，只进行常规的田间管理，不需要额外投入，不需要经特殊训练的人员操作。只需保证在开花期传粉昆虫能正常活动，收获前准确数荚，按高低排列并按选择压力选择即可，最为简单，最为高效。一次田间试验可测验成百上千被测材料，可操作性强，可行性强。

附图说明：

图1为本发明微型试验小区内的种植方式a示意图；

图2为本发明微型试验小区内的种植方式b示意图；

图3为本发明微型试验小区内的种植方式c示意图；

图4为本发明微型试验小区内的种植方式d示意图。

具体实施方式：

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1：

1）选择测验种：鉴定200份大豆早熟高产品系及新育成品种，选用同熟期具高昆虫传粉结实特性的大豆不育系jlcms34a做母本测验种。

2）田间种植方式：

在田间开放条件下，5月初播种，试验采用随机区组设计，三次重复，利用种植方式一（见图1），小区大小为1.3m×2.0m，相邻小区间隔1.0m，小区内2行播种，行距0.65m，每个小区内测验种与1份被测种质在同一行上左右相邻种植，间距20cm，行上测验种间或被测种质间穴距40cm，播种方式为穴播，播种量为每穴6粒，出苗后每穴定苗为2株。

3）母本不育系花粉育性检查：

在jlcms34a开花期，田间对jlcms34a植株进行花粉育性检查，拔除可育株，确保不育系的纯度，保证试验的精确性。

4）田间管理：

出苗后开花前，依据形态性状剔除杂株。进行3次除草，2次中耕，开花前喷施低残留杀虫剂除虫，开花后禁止施用杀虫剂，开花期减少田间操作活动，避免影响昆虫传粉效果。

5）测验种荚数调查统计，筛选对传粉昆虫吸引力高的材料

于jlcms34a植株上杂交荚鼓粒期时，在每个小区中间位置取样，每行分别连续取5穴共10株不育系植株，调查结荚数，按单株平均结荚数从高到低排序，选出结荚最多的前十份被测种质。

6）对10份传粉昆虫吸引力高的材料进行测交，其中3份为恢复系，育成了异交结实性高的恢复系，可直接用于配制杂交组合，进一步测验其配合力；2份为保持系，经过连续多代回交，育成了新不育系jlcms401a，jlcms402a，连续3年网室内扩繁制种，测定其异交结荚率分别为78.7%、82.3%，成功选育出异交结实性较高的不育系2份。

实施例2：

1）选择鉴定材料：鉴定139份育成不育系，鉴定母本为其本身，父本同型保持系。

2）田间播种方式：

在田间开放条件下，5月初播种，试验采用随机区组设计，三次重复，利用种植方式二（见图2），小区大小为1.95m×2.0m，相邻小区间隔1.0m，小区内3行播种，行距0.65m，小区内第2行播种不育系，第1、3行播种对应保持系，穴距20cm，播种方式为穴播，播种量为每穴6粒，出苗后每穴定苗为2株。

3）母本不育系花粉育性检查：

在每份不育系开花期，进行花粉败育率检查，拔出可育的植株，确保鉴定的精确性。

4）田间管理：

出苗后的田间管理，开花前进行3次除草，2次中耕，开花前喷施低残留杀虫剂除虫，开花后禁止施用杀虫剂，开花期减少田间操作活动，避免影响传粉效果。

5）母本结荚调查统计，筛选出高度吸引昆虫不育系

当每个不育系植株上杂交荚进入成熟期时，在每个小区父、母本行中间位置取样，分别连续取5穴共10株，调查结荚数，利用公式计算其结荚率，结荚率（%）=不育系结荚数/保持系结荚数×100，选育出异交结实性最高的不育系10份，田间结荚率分别为95.5%、94.6%、94.1%、93.8%、92.7%、91.9%、90.7%、88.3%、86.3%、85.1%，即为高度吸引昆虫不育系。

6）10份不育系连续3年在网室内扩繁制种，异交结荚率分别为85.9%、83.5%、81.7%、78.1%、83.2%、76.3%、72.3%、74.2%、71.9%、70.7%，成功鉴定出高异交结实性不育系10份。

实施例3：

1）选择测验种：鉴定182份jlcms47b×jlcms171b改良后代f5单株,所有单株均由一粒传法获得，选用同熟期具高异交结实特性的大豆不育系jlcms178a做测验种。

2）田间种植方式：

在田间开放条件下，5月初播种，试验采用随机区组设计，三次重复，利用种植方式三（见图3），小区大小为1.3m×2.0m，相邻小区间隔1.0m，小区内2行播种，行距0.65m，每行上测验种与1份被测材料前后相邻种植，播种方式为穴播，穴距20cm，播种量为每穴6粒，出苗后每穴定苗为2株。

3）母本不育系花粉育性检查：

jlcms178a开花期，在田间选择jlcms178a植株进行花粉败育率检查，拔出可育的植株，确保试验的精确性。

4）田间管理：

5）测验种荚数调查统计，筛选对传粉昆虫吸引力高的材料

在jlcms178a植株上杂交荚鼓粒期时，在每个小区中间位置取样，每行分别连续取5穴共10株不育系植株，调查结荚数，统计分析调查结果，鉴定出结实数最高的株系4份，即为对传粉昆虫吸引力高的群体。

这4份株系测交后均为保持系，经过连续多代回交，育成新不育系jlcms415a、jlcms416a、jlcms417a和jlcms418a，连续3年网室内扩繁制种，异交结荚率分别为76.3%、74.6%、82.3%和85.1%，成功选育出高异交结荚率不育系4份。

实施例4：

1）选择测验种：鉴定中早熟组152份大豆恢复系改良后代群体，选用同熟期具高异交结实特性的大豆不育系jlcms28a做测验种，该不育系具有叶片圆形、紫色花、棕色茸毛、褐色荚、亚有限结荚习性特征。

2）田间种植方式：

在田间开放条件下，5月初播种，试验采用随机区组设计，三次重复，利用种植方式四（见图4），因为混合随机播种测验种不育系和被测种质，所以2种材料播种时具体位置不确定，在图4中用“x”表示测验种不育系或被测种质植株，小区大小为1.3m×2.0m，相邻小区间隔1.0m，小区内2行播种，行距0.65m，每个小区内测验种与1份被测种质种子混合后在行上随机按穴播种，间距20cm，行上测验种间或被测种质间穴距40cm，播种量为每穴4粒，出苗后每穴定苗为2株。

3）母本不育系花粉育性检查：

于jlcms28a开花期，在田间选择具有紫花、圆叶、棕毛典型特征的jlcms28a植株，进行花粉败育率检查，拔出可育的植株，确保试验的精确性。

4）田间管理：

5）测验种荚数调查统计，筛选对传粉昆虫吸引力高的材料

在jlcms28a植株上杂交荚鼓粒期时，在每个小区中间位置取样，每行分别连续取10株具有棕毛、褐色荚、亚有限结荚习性不育系植株，调查结荚数，统计分析调查结果，鉴定得到结荚数最高的材料6份，即为对传粉昆虫吸引力高的材料。

6）对6份传粉昆虫吸引力高的材料进行测交，均为恢复系，利用这6份恢复系进行大豆杂交种制种试验，母本为另一个昆虫传粉结实性高且配合力高的不育系jlcms151a，杂交种制种田不育系jlcms151a平均单株结荚数分别达到43.7、45.3、42.5、40.7及39.3，在不育系jlcms151a制种田，不育系平均单株结荚数为42.3，其同型保持系平均单株结荚数为48.9，不育系jlcms151a的异交结荚率为42.3/48.9=86.5%，而以6份恢复系为父本制种田，对应不育系jlcms151a的异交结荚率分别为89.4%、92.6%、86.9%、83.2%及80.4%，证明6份恢复系均对不育系授粉效果好，即昆虫吸引力高。至此育成昆虫传粉结实性高的恢复系6份，可进一步测验其配合力。

本发明不仅在大豆种质对传粉昆虫吸引力的鉴定方法上具有三大突出优点，在杂交种亲本选育程序和方法上，也进行了革命性的彻底改良，实行了对传粉昆虫吸引力优先的策略。在三系开始选育之前，也就是在测交之前，预先对供试材料进行昆虫吸引力筛选，淘汰那些对传粉昆虫没有吸引力的材料，确保选出的三系高度吸引传粉昆虫，大大提高了育种效率和可预见性。同时微型鉴定小区占地面积小，适用于田间大规模鉴定，一公顷可鉴定种质1000份以上，本技术解决了对大量种质，特别是针对改良昆虫传粉结实性的杂交后代群体进行大规模昆虫吸引力鉴定的技术难题。