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以成熟胚为外植体的君子兰离体快速繁殖方法.pdf

花匠小妙招
2025-01-11 01:19

以成熟胚为外植体的君子兰离体快速繁殖方法
技术领域
本发明属于植物繁殖方法，具体涉及是花卉的无性快速繁殖方法。
背景技术
植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞的全能性，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等)、组织(如形成层、表皮、皮层、胚乳等)或细胞(如大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，形成完整的植株或产生具有经济价值的其它产品的技术。由植物组织培养所产生的再生植株除了极低的体细胞无性系变异外基本都能保持亲本(外植体来源植株)的优良性状。植物组织培养技术发明以来已经取得了很大的进展，自上世纪60年代以来植物组织培养已经从实验室研究阶段成为一种大规模成批量的工厂化生产方法。君子兰，是石蒜科君子兰属的多年生草本观赏植株。原产南非高山，性喜温凉，于本世纪初经由德国和日本引入我国，并安家落户。是我国名贵花卉，经济价值较高。它株型端庄、叶、花、果并美，深受国内外花卉爱好者的青睐。目前，君子兰的繁殖方式主要为种子繁殖与分株繁殖，而这两种方式的繁殖速度都很慢：君子兰一年只开一次花，且种子需要9个月才能成熟；分株繁殖一年最多分出1～3株。由于君子兰高度杂合，种子繁殖得到珍品君子兰的得率很低，即便以珍品君子兰做父母本得到珍品的几率仍很低，珍品君子兰在国内国际市场一直供不应求。利用植物组织培养技术离体快速繁殖君子兰可以大规模产生株型统一的珍品君子兰，进一步满足国内国际市场的需求。参考国际国内相关文献我们得知前人所做的君子兰组织培养实验虽然已经初步获得成功，但脱分化率及再生率低、依品种不同平均一块外植体能再生出零点几到二点几株苗。这就限制了君子兰组织培养技术在实际生产中的应用。本发明可使君子兰在一年以内实现真正的快速繁殖，非常适合工厂化生产。
发明内容
为克服君子兰传统繁殖方法产生君子兰个体株型千差万别、繁殖速度慢的缺点；也为了克服前人君子兰组织培养实验中脱分化率低、分化率低、再生周期长、不适合工厂化生产的缺点。提供一种以成熟胚为外植体的君子兰离体快速繁殖方法
本发明所采用的技术方案是：
1.外植体脱毒、接种及愈伤诱导：取成熟果实中的胚，放入无菌超净台中，用75％(体积/体积)酒精浸泡30～60秒，用0.1～0.2％(质量/体积)的升汞溶液浸泡2～5分钟，无菌水冲洗3～5遍，将裸胚上黄色致密的长度大约2mm的一端切下，接种在含2，4-D2～4mg/L、蔗糖3～4％(质量/体积)、琼脂0.45～0.7％(质量/体积)的MS培养基上，20～30℃每天40W日光灯照射8～9小时。40～50天继代一次，待愈伤(黄色)或者绿色膨大长到直径5mm左右时即可诱导分化。
2.不定芽的诱导：将生长状态良好的黄色愈伤或绿色膨大组织转接到诱导分化培养基：MS+KT(0.25～0.5mg/L)+2，4-D(0.75～1.5mg/L)+3～4％(质量/体积)蔗糖+0.45～0.7％(质量/体积)琼脂，40～50天继代一次，20～30℃每天光照8～12小时。30～40天可见再生芽产生。继代4个月时从一块愈伤可分化出200多株再生芽苗。
3.根的诱导：再生植株转到1/2MS+NAA(1～2mg/L)+蔗糖2％(质量/体积)+琼脂0.45～0.7％(质量/体积)的生根培养基上，20～30℃每天10小时左右光照。
4.再生植株移栽：植株生根后即可移栽。腐殖土121℃灭菌30～60分钟。移栽前将植株上的琼脂等杂物冲洗干净。7天左右浇一次透水便可成活。
本发明的优势在于：取材不受季节限制(成熟种子可长期保存)；外植体体积小，适合于农杆菌介导转基因；基于每粒种子的基因背景不尽相同(君子兰高度杂合，大多采用异花授粉)，可在一定程度上克服转基因沉默；使君子兰在相对短的时间内大量产生基因背景完全相同、株型统一的再生植株；再生体系稳定，以来源于10株成龄君子兰(包括彩叶君子兰)的成熟种胚为外植体的脱分化率及分化率均可达70％～100％；再生系数高，由原始的一块愈伤组织经反复继代可分化出几百株丛生芽；丛生芽生根率可达100％，生长健壮；移栽成活率高，可达100％。本发明的有益效果是可以使不同品种的君子兰在相对短的时间内大规模繁殖出遗传背景相同、外观整齐的植株，植株移栽后生长状态良好，平均单株再生苗的成本低，适合产业化生产。
具体实施方式
下面将结合实际操作对本发明作进一步的说明，但本发明的范围不仅局限于以下的实施例。
实施例1：
1.外植体脱毒、接种及愈伤诱导：取成熟果实中的种胚，于无菌超净台中75％(体积/体积)酒精浸泡30秒，用0.1％(质量/体积)的升汞溶液浸泡2分钟，无菌水冲洗3遍，将裸胚上黄色致密的长度大约2mm的一端切下，接种在含2，4-D2mg/L、蔗糖3％(质量/体积)、琼脂0.45％(质量/体积)的MS培养基上，20℃每天40W日光灯照射8小时。40天继代一次，待愈伤(黄色)或者绿色膨大长到直径5mm左右时即可诱导分化。
2.不定芽的诱导：将生长状态良好的黄色愈伤或绿色膨大组织转接到诱导分化培养基：MS+KT0.25mg/L+2，4-D0.75+3％(质量/体积)蔗糖+0.45％(质量/体积)琼脂，40天继代一次，20℃每天光照10小时。30～40天可见再生芽产生。继代4个月时从一块愈伤可分化出200多株再生芽苗。
3.根的诱导：再生植株转到1/2MS+NAA(1mg/L)+蔗糖2％(质量/体积)+琼脂0.45％(质量/体积)的生根培养基上，20C每天10小时左右光照。
4.再生植株移栽：植株生根后即可移栽。腐殖土121℃灭菌30分钟。移栽前将植株上的琼脂等杂物冲洗干净。7天左右浇一次透水便可成活。
实施例2：
1.外植体脱毒、接种及愈伤诱导：取成熟果实中的胚于无菌超净台中，用75％(体积/体积)酒精浸泡60秒，用0.2％(质量/体积)的升汞溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗5遍，将裸胚上黄色致密的长度大约2mm的一端切下，接种在含2，4-D4mg/L、蔗糖4％(质量/体积)、琼脂0.7％(质量/体积)的MS培养基上，30℃每天40W日光灯照射9小时。50天继代一次，待愈伤(黄色)或者绿色膨大长到直径5mm左右时即可诱导分化。
2.不定芽的诱导：将生长状态良好的黄色愈伤或绿色膨大组织转接到诱导分化培养基：MS+KT0.5mg/L+2，4-D1.5mg/L+4％(质量/体积)蔗糖+0.7％(质量/体积)琼脂，50天继代一次，30℃每天光照12小时。30～40天可见再生芽产生。继代4个月时从一块愈伤可分化出上百株再生芽苗。
3.根的诱导：再生植株转到1/2MS+NAA2mg/L+蔗糖2％(质量/体积)+琼脂0.7％(质量/体积)的生根培养基上，30℃每天10小时左右光照。
4.再生植株移栽：植株生根后即可移栽。腐殖土121℃灭菌60分钟。移栽前将植株上的琼脂等杂物冲洗干净。7天左右浇一次透水便可成活。
实施例3：
1.外植体脱毒、接种及愈伤诱导：取成熟果实的种胚于入无菌超净台中75％(体积/体积)酒精浸泡40秒，用0.15％(质量/体积)的升汞溶液浸泡4分钟，无菌水冲洗4遍，将裸胚上黄色致密的长度大约2mm的一端切下，接种在含2，4-D3mg/L、蔗糖3.5％(质量/体积)、琼脂0.6％(质量/体积)的MS培养基上，25℃每天40W日光灯照射8.5小时。48天继代一次，待愈伤(黄色)或者绿色膨大长到直径5mm左右时即可诱导分化。
2.不定芽的诱导：将生长状态良好的黄色愈伤或绿色膨大组织转接到诱导分化培养基：MS+KT(0.4mg/L)+2，4-D(1.0mg/L)+3.5％(质量/体积)蔗糖+0.5％(质量/体积)琼脂，45天继代一次，25℃每天光照8小时。30～40天可见再生芽产生。继代4个月时从一块愈伤可分化出200多株再生芽苗。
3.根的诱导：再生植株转到1/2MS+NAA(1.5mg/L)+蔗糖2％(质量/体积)+琼脂0.6(质量/体积)的生根培养基上，20～30℃每天10小时左右光照。
4.再生植株移栽：植株生根后即可移栽。腐殖土121℃灭菌45分钟。移栽前将植株上的琼脂等杂物冲洗干净。7天左右浇一次透水便可成活。