摘 要 为探究不同因素对铁皮石斛多糖凝胶特性的影响,研究多糖浓度、成胶温度、碱和离子对铁皮石斛多糖凝胶特性、持水性、乙酰基含量等的影响,通过差示扫描量热仪(DSC)、傅里叶红外光谱仪(FTIR)、X 射线衍射仪(XRD)对多糖的性质进行表征。结果表明,多糖质量浓度从5 mg/mL 增加到25 mg/mL 时,其凝胶强度从70.87 g 增加到206.39 g,持水性从78.52%增加到94.25%;在温度达到40 ℃时,凝胶强度达到最大为129.29 g,对应的持水性也最大为90.58%;随着不同碱(NaOH、Na2CO3、KOH、K2CO3)质量浓度的升高,凝胶强度均先持续增加后降低,凝胶的持水性均逐渐降低,在同等碱添加量条件下,形成的凝胶强度大小顺序为Na2CO3>K2CO3>NaOH>KOH;电解质方面,钠离子可以提高凝胶的强度和持水性,而尿素会显著降低凝胶的强度和持水性。FTIR 图谱表明:乙酰基的吸收峰强度随Na2CO3 添加量的升高而降低。多糖的脱乙酰程度与碱含量有关。XRD 结果表明:其衍射峰强度与碱的添加量有关,表现为碱添加量越高,衍射峰越强。DSC 结果表明:随着碱量的增多,水吸收峰的峰值温度升高,峰的热焓值增大。凝胶形成机理可能与乙酰基的水解促进多糖分子间的相互作用有关。
近年来,天然多糖因多种生物活性而备受关注,此外,一些植物多糖由于理想的功能特性,如胶凝、增稠和乳化特性,作为胶凝剂、增稠剂和乳化剂应用于食品和制药行业[1-4]。多糖凝胶的形成有利于改善产品的口感、稳定性、质构特性等。研究铁皮石斛多糖的凝胶性,对铁皮石斛多糖的应用具有重要意义。
铁皮石斛多糖是从铁皮石斛中提取的植物多糖,具有很高的生物活性和药用价值。其主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖组成[5],含有β-1,4-D-葡甘露聚糖的主链结构,在β-1,4-D-甘露糖残基的C2 位的O 上连有乙酰基,是一种天然的乙酰化多糖[6-8]。魔芋胶也是一种富含乙酰基的多糖,其凝胶化与乙酰基有很大的相关性,凝胶性质受多糖浓度、离子、碱浓度等因素的影响[9]。本课题组早期研究观察到一定质量浓度的铁皮石斛多糖水溶液,当体系的pH 值大于10 时出现胶凝现象,然而,铁皮石斛多糖的凝胶性还未见文献报道。研究铁皮石斛多糖的凝胶性质,可让多糖的凝胶性在食品等领域应用更广泛。
影响铁皮石斛多糖凝胶性的因素很多,例如:质量浓度,碱的种类及浓度,金属离子,处理方式等;不同条件形成的凝胶性质有很大差异。本研究旨在探究铁皮石斛多糖凝胶的可能形成机理,以期为铁皮石斛多糖在食品胶中的应用提供一定的理论依据。研究不同因素对铁皮石斛多糖凝胶质构特性和持水性能的影响,以及凝胶前、后乙酰基变化、热稳定性和结晶性的差异。
铁皮石斛(3 年生),安徽省霍山黑石渡生物科技有限公司;所用化学试剂均为分析纯级,上海泰坦科技股份有限公司。
AL204 电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海有限公司);DF-101S 恒温加热磁力搅拌器,上海豫康科教仪器设备有限公司;80-2B 离心机,江苏新康医疗器械有限公司;TA-XT plus 物性测定仪,英国Stable Micro System 有限公司;SYSTEM 200 X-射线衍射仪,德国Bruker AXS 公司;DSC-25 差式扫描量热分析仪,美国TA 公司;Nicolet iS10 傅里叶变换红外光谱仪,美国Thermo公司;FD-1A-50 真空冷冻干燥机,上海比朗仪器制造有限公司。
1.3.1 铁皮石斛多糖的制备 根据参考文献[10],采用水提醇沉法自制。铁皮石斛(DOP)干茎粉碎,加入10 倍体积无水乙醇溶液,静置72 h。收集铁皮石斛残渣,挥干溶剂,按料液比1∶25 的比例加入去离子水,于90 ℃水提2 h,重复5 次,提取液浓缩后加入4 倍体积的无水乙醇,于4 ℃冰箱中静置24 h,5 000 r/min 离心15 min,收集沉淀用无水乙醇清洗3 次后,加入去离子水溶解,过滤冻干得铁皮石斛粗多糖。去离子水溶解粗多糖,采用Sevag 法脱蛋白,所得多糖溶液层浓缩后醇沉静置过夜,离心收集沉淀,冻干后得到DOP。
1.3.2 多糖的化学成分测定 以葡萄糖为标准品,采用硫酸-苯酚法测定多糖中的总糖含量[11]。以半乳糖醛酸为标准品,采用硫酸-咔唑法测定多糖中的糠醛酸含量[12]。以牛血清蛋白为标准品,采用考马斯亮蓝法测定多糖中的蛋白质含量[13]。
1.3.3 DOP 的乙酰基含量测定 准确称取1.000 g 铁皮石斛多糖于锥形瓶中,加入50 mL 蒸馏水以150 r/min 搅拌,使铁皮石斛多糖充分溶胀。加入5 mL 0.5 mol/L 的NaOH 溶液,继续搅拌24 h,以1%的酚酞作为指示剂,用0.1 mol/L 的HCl 中和滴定过量的碱。每个样品重复测定3 次。乙酰基含量计算公式如下[14]:
式中,V1——样品组消耗的盐酸体积,mL;V2——空白对照组消耗的盐酸体积,mL;CHCl——盐酸浓度,mol/L;Macetyl=0.043 g/moL;ms——样品的质量,g。
1.3.4 DOP 凝胶的制备 配制质量浓度为15 mg/mL 的DOP 溶液20 mL,在室温下搅拌DOP 至彻底溶解。向烧杯中添加碳酸钠,使碳酸钠的质量浓度为15 mg/mL。以40 ℃加热搅拌20 min,立即灌入20 mL 的注射器内,密封,室温条件下静置24 h。待成胶后,切成直径为19 mm,高为15 mm的柱形小块,待测。
1.3.5 凝胶质构特性测定 使用TA-XT plus 物性测试仪,在TPA 质构模式下测定样品的质构特性,分别为硬度、弹性。参数如下:探头:P/0.5,测试前速度:4.0 mm/s,测试速度:1.0 mm/s,测试后速度:4.0 mm/s,测试距离:10.00 mm,感应力:5.0 g。
1.3.6 凝胶持水性(WHC)测定 参考Zhang 等[15]的测定方法,结合铁皮石斛多糖凝胶的性质做适当修改。将各方法制备的DOP 凝胶切成高度为3 cm 的小块,置于离心管中称重,4 000 r/min 离心30 min,弃去析出液体后再称重。按照以下公式计算,每个样品平行测定3 次。
式中,WHC——持水力,%;M1——离心管质量,g;M2——离心前凝胶样品与离心管总质量,g;M3——离心后凝胶样品与离心管总质量,g。
1.3.7 傅里叶变换红外光谱 准确称取1 mg 冻干样品粉末于玛瑙研钵中充分研磨,再加入100 mg 干燥至恒重的溴化钾粉末混合均匀,称取30 mg 混合物压片,采用傅里叶变换红外光谱仪进行谱图测定。测定范围为4 000~400 cm-1,分辨率为4 cm-1。
1.3.8 动态监测脱乙酰度 准确称取7 g 干燥至恒重的样品,置于烧杯中,加700 mL 蒸馏水于室温下用搅拌器搅拌,使多糖样品充分溶胀形成均一的胶液,配制质量浓度10 mg/mL 的DOP 溶液。取2 份200 mL 配制好的DOP 溶液分别置于烧杯中,添加Na2CO3 使其质量浓度分别为5 mg/mL 和15 mg/mL,于40 ℃持续搅拌。每隔15 min 从各烧杯中吸取10 mL 的胶液,以1%的酚酞作为指示剂,混匀后,用0.1 mol/L 的HCl 中和滴定过量的碱,计算脱乙酰过程中乙酰基的含量变化。脱乙酰度按公式(3)计算:
式中,A——脱除的乙酰基含量,%;A1——DOP 样品的总乙酰基含量,%。
1.3.9 X-射线衍射(XRD)分析 将样品研磨至细粉末状,干燥至恒重,取一定量进行X-射线衍射测定。测试条件为:辐射源为CuKα,管压40 kV,管流35 mA,准直器1 mm,Cu 靶陶瓷X 光管,二维探测器,扫描速度10°/min,步长0.02°,2θ 为5°~50°。
1.3.10 差式扫描量热(DSC)分析 准确称取2 mg 样品置于纯铝坩埚中,压盖密封,用针头在盖中心扎孔,以相同空坩埚做参比,采用DSC 设备在氮气环境下对样品热特性进行测定。测试范围30~200 ℃,速率为10 ℃/min,每个样品重复测定3次,结果用“平均值±标准差”表示。
采用SPSS 20.0 对试验数据进行分析,数据表示为“平均值±标准偏差”(),采用Origin 9.0 绘图。
用紫外分光光度计测定葡萄糖、糖醛酸、牛血清蛋白的标准曲线,苯酚-硫酸法所得的回归方程为:y=0.0117+9.779x,R2=0.9996;硫酸-咔唑法所得的回归方程为:y=0.0133+7.798x,R2=0.9956;考马斯亮蓝法所得的回归方程为:y=0.07743 +4.669x,R2=0.9973。将铁皮石斛多糖在几种条件下所测吸光度带入回归方程,计算铁皮石斛多糖的总糖、糖醛酸和蛋白质含量,结果见表1。
表1 DOP 的总多糖、糖醛酸、蛋白质和乙酰基含量
Table 1 The total polysaccharide,uronic acid,protein and ethanoyl content of DOP
由表1 可知经Sevag 法脱蛋白后所得的DOP,蛋白质含量为0.68%,总糖含量为89.38%,糖醛酸含量为2.19%,试验结果与He 等[16]的结果相似。采用化学滴定法测得的铁皮石斛多糖乙酰基的含量较高,为3.43%。结果表明铁皮石斛多糖是一种富含乙酰基的杂多糖。
由图1a 可知,铁皮石斛多糖的质量浓度对其凝胶强度产生了重要影响。随着多糖质量浓度的增加,铁皮石斛多糖凝胶的强度也逐渐增大,各组样品之间表现出显著性差异(P<0.05)。当多糖的质量浓度从5 mg/mL 增加到10,15,20,25 mg/mL时,其凝胶强度从70.87 g 分别增加到85.25,127.54,153.42,206.39 g。这可能是由于随着铁皮石斛多糖质量浓度的增加,溶液中单位体积内多糖分子链之间的相互作用增强,使得形成的凝胶三维网状网状结构更加致密,进而导致多糖凝胶强度增大[17]。
图1 不同因素对铁皮石斛多糖凝胶强度的影响
Fig.1 Effects of different factors on the DOP gel strength
图1b 为温度影响铁皮石斛多糖的胶凝过程,当温度从20 ℃升高到40,60,80,100 ℃时,凝胶的强度从108.34 g 分别变化为129.29,98.53,72.48,61.88 g,表现出随着温度的升高,凝胶强度先增加后降低的现象。有研究表明,凝胶形成过程中的作用力主要包括氢键、疏水作用力、共价键、静电作用等,而不同的凝胶维持其网络结构的作用力不同,例如冷致凝胶主要是由于氢键的作用(结冷胶、卡拉胶、明胶),即低温有利于氢键的作用;热致凝胶主要是疏水作用力的作用(魔芋胶、甲基纤维素),即温度升高可以增强疏水作用力[18-19]。
铁皮石斛多糖在低温条件和高温条件均可以形成凝胶,在高温条件下凝胶强度减弱,这是因为高温破坏了分子间的氢键作用,导致多糖凝胶强度降低,也间接说明了铁皮石斛多糖凝胶形成的主要作用力可能是氢键的作用,疏水作用力在铁皮石斛多糖凝胶的形成过程中不占主导地位,氢键的作用在Na+对铁皮石斛多糖凝胶强度的影响中被证实。
碱的添加可导致铁皮石斛多糖中乙酰基的水解[20],本研究观察到碱的添加是铁皮石斛多糖凝胶制备中的关键性条件。虽然铁皮石斛多糖分子主链上含有较多可以形成氢键的羟基,但是乙酰基的空间位阻阻碍了铁皮石斛多糖分子间的聚集,从而阻碍了分子间氢键的形成,不能发生胶凝现象。当乙酰基被水解时,空间位阻的消失有利于铁皮石斛多糖分子间氢键的形成,多糖分子间相互缠结,形成稳定的网络结构。由图1c~1f 可知,碱的种类和浓度对铁皮石斛多糖的凝胶强度有重要影响,当15 mg/mL 的DOP 水溶液中碱的添加量从5 mg/mL 变为10,15,20,25 mg/mL 时,胶凝后,添加NaOH 的DOP 凝胶的强度从90.65 g 变为107.55,126.56,115.69,109.56 g;添加Na2CO3的DOP 凝胶的强度从98.48 g 变为115.37,131.52,154.83,149.62 g;添加KOH 的DOP 凝胶的强度从81.75 g 变为98.64,105.37,110.54,104.79 g;添加K2CO3 的DOP 凝胶的强度从93.75 g 变为109.26,129.78,117.36,113.28 g。结果表明,随着碱添加量的增加,凝胶强度先持续增加后分别降低(P<0.05),DOP 凝胶在高质量浓度碱液中凝胶强度降低,可能由于当碱的质量浓度过高时,会加速乙酰基的水解,从而加快分子间的相互作用,致使形成的网络结构不均一,较为疏散。
添加不同碱液形成的DOP 凝胶的强度明显不同,最大峰值受碱的性质影响。15 mg/mL 的DOP 溶液在同等碱添加量条件下,形成的凝胶强度大小顺序为Na2CO3>K2CO3>NaOH>KOH,表现为中强碱(Na2CO3、K2CO3)形成凝胶比强碱(NaOH、KOH)形成的凝胶的强度更高,这一现象与强碱对魔芋胶的作用相似,这可能是因为,多糖凝胶在强碱的作用下,会随着时间的延长出现部分降解[21]。同等条件下,添加Na2CO3 比K2CO3 形成的DOP 凝胶强度大,NaOH 比KOH 形成的DOP凝胶强度大,这可能是由于Na+比K+使多糖具有更坚硬的内部结构,在Na+的存在下,有利于多糖分子间的相互作用,然而在K+存在下,这些现象则会减少。
多糖在碱性条件下会发生乙酰基的水解,从而改变多糖的分子结构,影响氢键作用和静电作用[22-23]。为了证明氢键作用力和静电作用力在铁皮石斛多糖胶凝过程中的作用,考察了Na+和氢键断裂剂-尿素对铁皮石斛多糖凝胶强度的影响。如图1g 所示,随着NaCl 的加入,铁皮石斛多糖的凝胶强度逐渐增加,这是因为在铁皮石斛多糖交联的网状结构中,多糖内部电荷密度过大,多糖分子间静电斥力不利于凝胶网络结构的形成,而Na+的添加可以屏蔽多糖分子内部的部分静电斥力,因此,NaCl 的加入可以提高铁皮石斛多糖的凝胶强度[24-26]。如图1h 结果显示,随着尿素的加入,多糖的凝胶强度显著降低(P<0.05)。当尿素浓度从0 mol/L 增加到0.001,0.005,0.01,0.05 mol/L 时,铁皮石斛多糖的凝胶强度分别从118.58 g 变为106.56,90.27,78.78,70.6 g,即随着尿素添加量增加凝胶强度下降,提示尿素的存在影响了氢键的形成,进而降低了多糖凝胶的刚性网络结构,同时,高浓度尿素对凝胶强度的影响曲线较平缓,推测氢键只是影响石斛多糖凝胶强度的因素之一,还存在其它的主要影响因素。以上结果说明,铁皮石斛多糖凝胶网络的形成过程中,可能有氢键和静电作用的影响,而具体的供氢基团及凝胶形成的主要作用力还有待进一步研究。
持水性是多糖水凝胶的重要功能之一,持水性可以反映多糖凝胶网络结构的致密程度[27]。多糖的质量浓度、碱的种类与添加量、温度及电解质对铁皮石斛多糖凝胶持水性的影响见图2。
图2 不同因素对铁皮石斛多糖凝胶持水性的影响
Fig.2 Effects of different factors on water holding capacity of DOP gel
图2a 结果表明,随着铁皮石斛多糖质量浓度的增加,凝胶持水性逐渐增强。当铁皮石斛多糖质量浓度从5 mg/mL 增加到25 mg/mL 时,凝胶的持水性从78.52%增加到94.25%,这是因为随着多糖质量浓度的升高,溶液中单位体积内的多糖分子数量增加,分子间的相互作用增强,形成更加致密的网络结构,对水的束缚能力增强[28]。如图2b,随着温度升高,多糖的持水性逐渐降低,表现为当温度从40 ℃变为60,80,100 ℃时,铁皮石斛多糖的持水性从90.58%分别变为87.47%,82.56%,72.18%,这是由于升高温度破坏了铁皮石斛多糖分子与水分子间的氢键。
由图2c~2f 可知,随着溶液中碱的质量浓度升高,凝胶的持水性逐渐降低,这是因为碱的浓度越高,铁皮石斛多糖的脱乙酰度越高,导致多糖分子间的作用增强,因此持水性降低。由图2c~2f 可知,同等质量浓度下,Na2CO3 制备的多糖凝胶的持水性比NaOH 强,K2CO3 制备的多糖凝胶的持水性比KOH 强,可能因为Na2CO3 与K2CO3 的碱性相对较弱,多糖的脱乙酰速度较慢,形成的凝胶网络更为有序。同等条件下,添加Na2CO3 比K2CO3 形成的DOP 凝胶持水性强,NaOH 比KOH 形成的DOP 凝胶持水性强,这可能是由于Na+的存在形成了更加致密的凝胶网络结构。
不同浓度的Na+和尿素对铁皮石斛多糖凝胶的持水性的影响如图2g 所示,当Na+浓度从0 mol/L 增加到0.001,0.005,0.01,0.05 mol/L 时,DOP 凝胶的持水性分别从91.85%变为92.08%,92.14%,92.48%,92.64%,即凝胶的持水性随Na+浓度的升高逐渐增强,这可能是因为Na+的存在下,有利于多糖分子间的相互作用,有助于改善多糖螺旋线圈的尺寸,从而形成更加致密的凝胶网络结构[29],离心条件下水分不容易脱离。如图2h所示,当尿素浓度从0 mol/L 增加到0.001,0.005,0.01,0.05 mol/L 时,DOP 凝胶的持水性分别从91.85%变为88.98%,85.14%,82.39%,78.45%,即凝胶的持水性随尿素浓度的升高逐渐下降,这是因为尿素的存在影响了多糖分子间氢键的形成,从而破坏了多糖凝胶的网络结构,对水的束缚能力降低,其次,尿素的添加也会破坏多糖分子与水分子间的氢键,导致与分子间的相互作用减弱,持水性降低。
经2 种质量浓度Na2CO3(5 mg/mL 和15 mg/mL)处理前、后的DOP 的红外光谱扫描结果见图3,波数在3 417.1 cm-1 左右的宽峰是羟基的伸缩振动吸收峰[30],波数在2 935 cm-1 和2 881 cm-1 处的吸收峰是甲基和亚甲基C-H 键的伸缩振动引起的[14],1 735.1 cm-1 的吸收峰是乙酰基中C=O 非对称伸缩振动峰[31],波数在1 000~1 300 cm-1 区域以及810.4 cm-1 和897.6 cm-1 处存在的吸收峰是铁皮石斛多糖中甘露吡喃糖苷的特征吸收峰,这些结果与前人研究[32]结果一致。由图3 可知,不同质量浓度Na2CO3 处理的DOP 样品,在波数1 735.1 cm-1 处乙酰基的吸收峰强度有很大差别,表现为随着Na2CO3 添加量的升高而降低。研究表明,乙酰基吸收峰强度的减弱是由于在碱性条件下,铁皮石斛多糖中的乙酰基发生水解引起的,乙酰基水解程度越高,其红外吸收峰强度越弱。
图3 不同Na2CO3 添加量条件下的DOP 红外图谱
Fig.3 FT-IR spectrum of DOP with addition of Na2CO3 at different levels
为进一步了解铁皮石斛多糖胶凝过程中乙酰基含量的变化,对铁皮石斛多糖胶凝过程中的乙酰基脱除情况做动态监测。由图4 可知,两种质量浓度Na2CO3 处理的铁皮石斛多糖的脱乙酰速率均表现为先迅速增加,然后逐渐趋于平缓。同时,脱乙酰的程度与碱的添加量有关,Na2CO3 的添加量越高,脱乙酰程度越高,这一现象与2.4 节的红外结果相符合。
图4 Na2CO3 条件下DOP 的脱乙酰度动态图
Fig.4 Profile of deacetylation of DOP with addition of Na2CO3
X-射线衍射图可以确定分子的无定形或结晶特性。由XRD 图谱(图5)可知,未经Na2CO3 处理的DOP 呈现出一种无定形状态,只在2θ=20°处有一个较宽的衍射峰,这是因为铁皮石斛多糖中含有大量的无定形区域,少量的结晶区隐藏在无定形区域内,整体上呈现出一种相对无定形的状态。当碱的添加量为5 mg/mL 和15 mg/mL 时,DOP 凝胶样品在2θ=26.05°和27.55°时有明显的衍射峰,产生了明显的结晶区,其衍射峰强度与碱的添加量有关,表现为碱添加量越高,衍射峰越强。
图5 不同Na2CO3 添加量条件下的铁皮石斛多糖XRD 图谱
Fig.5 XRD patterns of DOP with addition of Na2CO3 at different levels
由DSC 曲线图(图6)可知,铁皮石斛多糖在40~160 ℃之间有1 个宽的吸热峰,推测是水丢失的吸热峰,该峰的峰值和热焓值可以间接反映出水分子和铁皮石斛多糖分子间相互作用强度。图6 显示随着碱量的增多,峰值温度升高,具体表现为,当添加的碱量从0 mg/mL 增加到15 mg/mL时,水的吸收峰值从111.37 ℃增加到125.25 ℃。经碱处理的吸热峰的热焓值从198.4 J/g 增加到270.1 J/g,这可能是因为随着碱的添加量增大,铁皮石斛多糖分子的脱乙酰程度增加,多糖分子间的相互作用强度增大,导致自由水流失,此时多糖与水分子之间主要以结合水形式存在,较难失去,因此水分吸热峰值温度提高,热焓值增大。
图6 不同Na2CO3 添加量条件下的铁皮石斛多糖DSC 图谱
Fig.6 DSC curves of DOP with addition of Na2CO3 at different levels
综合上述研究结果,推测铁皮石斛多糖的凝胶机理(图7):(1)铁皮石斛多糖乙酰基水解是铁皮石斛多糖发生胶凝现象的决定性因素,这一点已经由红外图谱和动态监测乙酰基的数据所证实。(2)温度、电解质对凝胶性能的影响结果表明,氢键作用力可能是铁皮石斛多糖形成凝胶网络的主要作用力之一,还有其它作用力。综合来说,乙酰基的水解可能是铁皮石斛多糖胶凝的引发阶段,乙酰基水解后,多糖分子链之间的空间位阻消失,有利于富含羟基的铁皮石斛多糖分子间的相互作用,最终形成铁皮石斛多糖凝胶。
图7 铁皮石斛多糖的凝胶机理
Fig.7 The proposed gelling mechanism of DOP gels
本文研究了影响DOP 凝胶特性的因素,结果表明,多糖的质量浓度越高,凝胶特性和持水性越好;在40~100 ℃之间,随着温度的升高,凝胶特性和持水性逐渐降低;随着溶液中碱质量浓度的升高,凝胶的强度先持续增加后降低,而凝胶的持水性逐渐降低;在同等碱添加量条件下,形成的凝胶强度大小顺序为Na2CO3>K2CO3>NaOH>KOH;钠离子可以提高凝胶的强度和持水性,而尿素会降低凝胶的强度和持水性。DOP 在胶凝的过程中会发生乙酰基水解,脱乙酰的程度与碱浓度有关,铁皮石斛多糖脱乙酰后,分子链之间相互作用加强,最终形成稳定的网络结构。在强碱条件下,凝胶形成的速度较快,这一性质使得铁皮石斛多糖作为胶凝剂,在食品工业应用中,有利于满足产品对胶凝时间的要求。
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