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基于网络药理学和分子对接的黄蜀葵花干预糖尿病肾病的作用机制研究

花匠小妙招
2025-01-13 16:40

摘要：目的运用网络药理学和分子对接的方法研究黄蜀葵花干预糖尿病肾病的多成分、多靶点、多通路作用机制，旨在为其基础研究及临床应用提供依据。方法通过ETCM 、HERB 数据库结合文献报道，筛选黄蜀葵花活性成分，并通过PharmMapper 数据库预测其潜在靶点，建立靶点数据库。通过Genecards 、OMIM 、Drugbank 、TTD 等数据库筛选糖尿病肾病相关靶点，应用R4.1.0 软件取两者交集靶点。通过STRING 平台获得蛋白互作（PPI ）关系，并应用Cytoscape 3.8.2 构建PPI 网络并分析其中关键靶点。通过David 数据库进行基因本体论（GO ）和京都基因和基因组百科全书（KEGG ）基因富集分析，得到黄蜀葵花干预糖尿病肾病的潜在作用通路，采用Cytoscape3.8.2 构建“成分–作用靶点–通路”调控网络，使用AutoDock Vina 1.1.2 软件进行分子对接验证。结果从黄蜀葵花中筛选出43 个活性成分，其中涉及糖尿病肾病作用靶点44 个，Cytoscape 分析最终筛选出9 个关键靶点。GO 富集分析结果显示，根据P 值＜0.05 ，筛选出生物过程（BP ）120 个，细胞组分（CC ）23 个，分子功能（MF ）37 个。KEGG 富集分析结果显示，黄蜀葵花主要作用于肿瘤坏死因子（TNF ）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK ）等信号通路。分子对接结果显示，大部分靶点与成分的结合活性较好。结论基于网络药理学探讨了黄蜀葵花干预糖尿病肾病多成分–多靶点–多通路的作用特点，预测黄蜀葵花主要活性成分槲皮素-3- O - 刺槐糖苷、芦丁、槲皮素-3'- O - 葡萄糖苷、银椴苷等，可能通过白蛋白（ALB ）、表皮生长因子受体（EGFR ）、雌激素受体（ESR1 ）、过氧化物酶体增值因子活化受体（PPARG ）、凝血酶原（prothrombin ，F2 ）等靶点，作用于肿瘤坏死因子TNF 、MAPK 等信号通路干预糖尿病肾脏病，为进一步开展黄蜀葵花干预糖尿病肾病作用机制研究提供了新的思路和方法。

糖尿病肾病是糖尿病患者常见微血管并发症，起病隐匿，通常以进行性肾功能衰退和蛋白尿为显著特征，其病变范围可累及肾脏的血管、间质、肾小球，甚至损伤全肾，且进展至终末期肾病的速度大约是其他肾脏疾病的14 倍，在严重影响患者的生存质量的同时，给社会带来了巨大的经济负担[1-2] 。2019 年国际糖尿病联盟（Intemational Diabetes Federation ，IDF ）发布的数据显示[3] ，全球20 ～79 岁成人糖尿病患者约4.63 亿，其中20% ～40% 的患者合并糖尿病肾病，可见糖尿病肾病的高患病率已成为世界性的重大公共卫生问题之一。随着中医药治疗糖尿病肾病研究的不断深入，中药在调节糖脂代谢、改变血流动力学等延缓肾脏病变作用越来越受到人们的关注[4] 。

黄蜀葵花为锦葵科秋葵属植物黄蜀葵Abelmoschus manihot (Linn.) Medic. 的花，其味甘、辛；性凉，归心、肾、膀胱经，具有清热利湿、利尿通淋、活血、止血、消肿解毒的功效，主治淋证、吐血、衄血、崩漏、胎衣不下、痈肿疮毒、水火烫伤[5] 。现代研究表明，黄蜀葵花主要含有黄酮类、有机酸类、核苷和氨基酸类等多种化学成分，其中黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化、保护心肌、脑缺血性损伤等多种药理活性[5] 。近年来，黄蜀葵花及其制剂—黄葵胶囊在糖尿病肾病的治疗中应用广泛且疗效显著[6-8] 。但目前对于黄蜀葵花干预糖尿病肾病的药理学作用机制的研究相对匮乏。网络药理学通过高通量筛选及分析技术预测药物及其作用靶点、疾病之间相互作用的复杂性与整体性及相关药理学机制，为目前揭示中药的复杂作用机制方面重要方法之一[9] 。本研究通过网络药理学及分子对接的方法，在分子的水平上，从化学成分、作用靶点和信号传导通路对黄蜀葵花干预糖尿病肾病的作用机制进行系统研究，以期为进一步揭示黄蜀葵花的药理作用机制提供理论基础。

1方法

1.1黄蜀葵花相关成分及靶点筛选

通过中医药百科全书数据库（ETCM ，http:// www.tcmip.cn/ETCM/index.php/home/index/ ）[10] 、本草组鉴（HERB ）数据库（http://herb.ac.cn/ ）[11] 检索黄蜀葵花中所有化学成分，并结合查阅文献对化学成分信息进行补充整理，并通过ChemBioDraw 14.0 画出其2D 结构图，构建黄蜀葵花活性成分二维数据库。将所获取化合物结构导入SwissADME 平台（http://www.swissadme.ch/ ）[12] 。设置潜在核心化合物的标准为：（1 ）肠胃吸收（gatrointestinalabsortion; GIabsortion ）为“High ”，表明成分具备良好口服生物利用度；（2 ）设置5 类药性预测（lipinski 、ghose 、veber 、egan 、muegge ）结果中有2 个及2 个以上为“yes ”。通过文献核查根据筛选标准所排除的化合物，若化合物药理作用明显且与糖尿病肾病研究主题相关，仍予以纳入，最终获得研究主题相关的潜在化合物。将筛选的潜在化合物导入PharmMapper 平台（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ ）[13] 获取靶点，选择NF ＞0.9 的靶点蛋白作为潜在靶点，在此基础上根据已发表的药物相关成分文献报道，补充已验证的相关靶点。

1.2糖尿病肾病相关靶点获取

以“diabetic kidney disease ”“diabetic nephropathy ”“DKD ”“DN ”为关键词，分别在Genecards 数据库（https://www.genecards.org/）[14]、OMIM数据库（https://omim.org/）[15]、Drugbank数据库（https://go.drugbank.com/）[16]、TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）[17]、DisGeNet数据库（https://www.disgenet.org/ ）[18] 等疾病基因数据库进行检索与筛选，将结果合并去重后即为糖尿病肾病相关靶点。用R4.1.0 软件将成分、靶点相互映射，得到黄蜀葵花干预糖尿病肾病的潜在靶点。

1.3活性成分–靶点网络的构建

依据黄蜀葵花干预糖尿病肾病的潜在靶点建立活性成分–靶点网络文件，将结果导入Cytoscape 3.8.2 软件中，构建“活性成分–靶点”网络。网络图的节点（node ）分别为活性成分、靶点。各节点之间的相互关系以边（edge ）表示。利用Cytoscape 3.8.2 软件中CytoNCA 插件对网络图进行分析，导出分析结果，得到黄蜀葵花候选成分中干预糖尿病肾病的主要药效成分及核心靶点。

1.4蛋白互作（PPI）网络的构建及关键靶点筛选

将1.2 项中得到的交集基因导入STRING 数据库（https://www.string-db.org/ ）[19] ，限定研究物种为“Homo sapiens ”，最低相互作用评分设置为0.400 ，其余参数保持默认设置，得到黄蜀葵花干预糖尿病肾病的PPI 网络，并将结果导入Cytoscape 3.8.2 软件中，利用网络分析功能分析PPI 网络中核心靶点，筛选出PPI 网络中药物和疾病核心靶点。

1.5基因本体论（GO）功能分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

将1.2 项中得到的交集基因导入David 数据库（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp ）进行GO 的生物过程（biological process ，BP ）、分子功能（molecularfunction ，MF ）、细胞组分（cell component ，CC ）及KEGG 通路富集分析，并使用R4.1.0 软件将结果可视化。

1.6“成分–靶点–通路”网络的构建

将上述得到的黄蜀葵花活性成分、潜在作用靶点、KEGG 富集到的主要相关通路富集分析结果导入Cytoscape 3.8.2 中，构建“成分–靶点–通路”网络。

1.7 分子对接

选择1.4项中筛选出的PPI网络中核心靶点与1.3中筛选出的黄蜀葵花前10种主要活性成分进行分子对接。第1步从PDB数数据库（https://www.rcsb.org/）下载PPI网络中关键靶点PDB格式的3D结构，将筛选的黄蜀葵花活性成分使用ChemOffice 2014软件使其能量最小化并另存为mol2格式；第2步运用AutoDockTools 1.5.6软件对蛋白质靶点进行去水、加氢等操作，并将活性成分及靶蛋白格式转换为pdbqt格式；最后通过AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接。若结合能＜−4.25 kcal/mol（1 cal＝4.4 J），表明配体分子能与受体蛋白进行自发的结合，若结合能＜−5.0 kcal/mol表明两者具有较好的结合性，若结合能＜−7.0 kcal/mol表明两者具有强烈的结合活性，最后选取部分结合力较强结果利用Pymol软件进行可视化。

2结果

2.1化学成分及对应靶点的采集

通过ETCM 、HERB 数据库结合文献[7, 20-25] 查询，包括《中国药典》（2020 年版）[26] 等，共搜索到80 个化合物，主要包括金丝桃苷、杨梅素等黄酮类化合物38 个，赖氨酸、丝氨酸等氨基酸类化合物10 个，腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷等核苷类化合物10 个，没食子酸、5- 羟甲基糠酸等有机酸类化合物13 个，豆甾醇、β- 谷甾醇等甾类化合物4 个，正三十烷醇、黄蜀葵神经酰胺等其他化合物5 个。通过SwissADME 平台结合文献查询共筛选出高活性成分43 个，见表1 。

2.2疾病靶点获取

以“diabetickidney disease”“diabetic nephropathy”“DKD”为关键词，在Genecards、OMIM 、drugbank 、TTD 、DisGeNet 等疾病基因数据库进行检索与筛选，其中Genecards 数据库3 488 个，选择relevancescore ＞5.84 的靶点作为目标靶点，OMIM 数据库253 个，Drugbank 数据库10 个，TTD 数据库19 个。汇总后去重，共得到1 814 个疾病基因。将疾病靶点与活性成分靶点取交集，得交集靶点44 个，运用R4.1.0 软件绘制韦恩图，见图1 。

2.3活性成分–靶点网络构建

运用Cytoscape 3.8.2 构建成分–靶点网络图，并通过CytoNCA 插件分析黄蜀葵花干预糖尿病肾病靶点网络拓扑学参数，得到核心成分及核心作用靶点。如图2 所示，此网络由87 个节点和268 条边构成，包括43 个活性成分，44 个潜在靶点节点，其中圆形节点代表潜在靶点，方形节点代表黄蜀葵花中的活性成分，连线代表三者之间的相互作用，图中节点面积越大，表明其在网络中越重要。

通过分析可知，该网络平均连接度为7.30 ，平均介度为0.015 ，平均紧密度为0.426 ，进一步分析发现其中10种成分连接度、介度、紧密度大于或等于其平均值，如反油酸（Kh31）、银椴苷（Kh11）、杨梅素-3-O -β-D -葡萄糖苷（Kh13）等，推测其可能为黄蜀葵花干预糖尿病肾病的主要成分，具体拓扑学参数见表2。网络图中丁酰胆碱酯酶（BCHE）、表皮生长因子受体（EGFR）、谷胱甘肽硫转移酶P1（GSTP1）、亲环蛋白（PPIA）、凝血酶原（prothrombin，F2）、β-分泌酶1（BACE1）等靶点基因分别与26、21、18、17、15、13个成分相连，具体拓扑学参数见表3。说明黄蜀葵花干预糖尿病肾病是多靶点、多成分共同作用的结果。

2.4黄蜀葵花干预糖尿病肾病潜在作用靶点PPI网络构建

将44 个交集基因上传至STRING 数据库，将得到的PPI 网络结果导入Cytoscape 3.8.2 软件构建网络图，节点颜色及大小根据度值（degree ）调整，度值越大，节点颜色越深、越大，见图3。通过分析可知，该网络平均连接度为9.49，平均介度为0.539，平均紧密度为0.022，进一步分析发现其中9种成分连接度、介度、紧密度大于或等于其平均值，即为黄蜀葵花干预糖尿病肾病的核心靶点，具体体拓扑学参数见表4。

2.5GO和KEGG通路富集分析

通过David 数据库对交集基因进行GO 和KEGG富集分析。GO富集分析结果显示，根据P＜0.05 ，筛选出BP[ 如蛋白质水解、纤维蛋白分解、雌激素应答、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK ）级联的调控等]120 个，CC （如细胞外组份、细胞外外来体等）23 个，MF （如酶结合、丝氨酸型内肽酶活性、MAP 激酶活性等）37 个，KEGG 富集共得到60 条通路，排除与糖尿病肾病无关的通路，选取P 值排名前20 的信号通路进行可视化，其中主要包括肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、催乳素信号通路、叉头框转录因子O（FoxO）信号通路、MAPK信号通路等，见图4、5。进一步用Cytoscape 3.8.2软件构建成分–靶点–通路网络图，见图6，结果显示44个潜在靶点中有23个参与了前20条通路的富集，且通路之间非独立分开，而是有共同靶点相互交织，表明黄蜀葵花可作用于多条通路，且各通路间相互影响，共同起到干预糖尿病肾病的作用。

2.6分子对接分析

将PPI 网络中筛选出的9 个核心靶点白蛋白（ALB ，PDBID ：6YG9 ）、EGFR （PDBID ：5UG9 ）、ESR1 （PDBID ：7BAA ）、半胱氨酸蛋白酶3 （CASP3 ，PDBID ：5IBP ）、纤溶酶原（PLG ，PDBID ：6D3Y ）、MAPK1 （PDBID ：6SLG ）、KDR （PDBID ：6GQQ ）、过氧化物酶体增值因子活化受体（PPARG ，PDBID ：6MS7 ）、F2 （PDBID ：5AFY ）与黄蜀葵花前10 种主要活性成分进行分子对接，结合能统计结果如图7 所示，图中颜色越深，代表配体分子能与受体蛋白结合力越强。在90 组受体–配体对接组合中，结合能＜−5.0kcal/mol 有87 组，结合能＜−7.0 kcal/mol 有67 组，占74.44% ，表明黄蜀葵花主要活性成分与核心靶点有强烈的结合活性。因此，黄蜀葵花可能通过以上关键靶点干预糖尿病肾病相关通路，达到改善或者治疗糖尿病肾病的作用。部分关键靶点与活性较强的化合物的结合模式见图8 ，由图可知，黄蜀葵花活性成分主要通过氢键、π-π 和π-cation 等相互作用与目标靶点结合，这些相互作用为活性成分与目标蛋白的结合提供了较强的结合力。

3讨论

糖尿病肾病属于中医学“脾瘅”“肾消”“水肿”等范畴，通常以本虚标实、虚实夹杂为主要病机，并伴有瘀血、水湿、痰浊等实邪阻伤肾络，因此历代医家多以益气养阴、健脾补肾、活血逐瘀和利湿化浊之法治疗。《医方考》云：“下焦之病，责之于湿热”。近年来，湿热与糖尿病肾病的发生发展越来越受到学术界重视[27] 。糖尿病肾病患者病位在肾，病久迁延不愈，肾阳温煦失司，脾阳不振，则水湿运化无力，凝聚下焦，郁久而化热，耗伤肾之阴液，进一步加重病情。诸多学者均主张在糖尿病肾病辨治时重视湿热论治[28-30] 。黄蜀葵花味甘、辛，性凉，归心、肾、膀胱经，长于清热利湿、利尿通淋，与糖尿病肾病治疗中从湿热论治不谋而合。

本研究采用网络药理学方法，对黄蜀葵花治疗糖尿病肾病有效成分及作用机制进行初步探析。通过数据库检索并筛选得到黄蜀葵花43 个有效活性成分，包括等金丝桃苷、槲皮素、异槲皮苷、二氢杨梅素等，提示这些成分可能在治疗糖尿病肾病过程中发挥重要药理作用。研究显示，金丝桃苷可通过调节单磷酸腺苷活化蛋白激酶–Unc-51 样自噬激活激酶1 （AMPK-ULK1 ）信号通路，抑制自噬活性，保护肾脏免于衰老和损伤[31] ，槲皮素可通过调控肾脏Toll 样受体4/ 核转录因子-κB （TLR4/NF-κB/Snail1 ）信号通路，减轻炎症反应抑制肾脏纤维化，发挥对糖尿病大鼠的肾脏保护作用；同时，体外细胞实验证实，槲皮素能够显著抑制肾小管上皮细胞中转化生长因子β 的表达，减轻肾组织的纤维化[32] 。陈杰彬等[33] 研究显示，异槲皮苷可通过抑制ERK 激酶（MEK ）/ 细胞外调节蛋白激酶（ERK ）信号通路并促进核因子E 2 相关因子1 （Nrf1 ）表达，实现对糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化的修复。Cai 等[34] 研究显示，黄葵胶囊中黄酮类活性成分棉皮素-8- 葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷等可通过抑制NADPH/ROS/ERK 信号通路改善慢性肾功能衰竭大鼠肾小管间质纤维化。

PPI 网络分析发现，ALB 、EGFR 、雌激素受体（ESR1 ）、CASP3 、PPARG 、F2 等靶点在黄蜀葵花干预糖尿病肾病的生物过程中可能起关键作用。ALB 是由肝脏合成的一种球状蛋白，具有维持血清胶体渗透压、抗感染及抗氧化性的作用，常用于评价机体营养状态[35] ，此外尿白蛋白是糖尿病肾病筛查、诊断、分期的重要依据，同时也是影响糖尿病肾病预后的重要因素[36] 。既往研究结果显示，血清白蛋白与糖尿病肾病严重程度呈负相关[37] 。肾小球滤过功能随疾病进展而进行性减退，尿白蛋白进行性增加，血清白蛋白水平下降，致使患者出现水肿，低蛋白血症等一系列并发症，进一步加重疾病进展。EGFR分布于所有血管上皮细胞，可通过参与RAS/RAF/MEK/MAPK、PI3K/PDK1/AKT等途径干预细胞生长、分化、增殖。多项体内外研究表明，EGFR参与血流动力学和代谢改变、慢性炎症和实质细胞功能障碍多种病理过程[38] 。Prada等[39] 研究发现，抑制EGFR可以显著改善胰岛素敏感性和胰腺β细胞功能来延缓糖尿病肾病进展。ESR1可与激素发生特异性结合而形成激素–受体复合物，使激素发挥其生物学效应，且研究发现其在维持线粒体稳态，降低血管紧张素2和内皮素的合成，抑制肾脏血管收缩及减轻肾脏炎症方面也发挥着重要作用[40] 。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）是细胞凋亡的核心成分，其中Casepase（CASP）-3是位于最下游的执行性凋亡蛋白酶，诱导组织细胞凋亡。Wen等[41]研究发现，糖尿病肾病是一种由效应物CASP3、CASP6和CASP7介导的细胞程序性死亡，抑制CASP3可改善糖尿病小鼠的蛋白尿、肾功能和肾小管间质纤维化。过氧化物酶体增值因子活化受体（PPARs）主要参与脂肪生成、能量平衡和脂质生物合成的调节，主要包括3种亚型PPARα、PPARγ、PPARβ/δ，是治疗糖尿病、糖尿病肾病的一大重要靶点[42] 。此外，研究显示PPARα、γ双重激动剂有可能用作治疗2型糖尿病和糖尿病肾病的新药物，并且不会引起与PPARγ激活相关的心脏副作用[43] 。Ge等[44] 研究显示，黄葵胶囊可通过激活PPARα、γ减轻糖尿病肾病大鼠的内质网应激和脂质代谢紊乱，从而改善肾病损伤，延缓疾病进展。F2是凝血酶的前身物质，研究表明，凝血纤溶系统异常及微血管内皮细胞损伤均参与了糖尿病肾病的发病过程[45] 。糖尿病肾病患者因代谢紊乱往往合并血管内皮细胞损伤，导致血小板和凝血纤溶系统异常及血液流变学改变，且随着病情的持续发展，患者的凝血因子活性上调，进而引起纤维蛋白沉积及肾小球细胞外基质增加，最终导致肾小球硬化的发生[46] 。Wang等[47] 对550名糖尿病患者进行横断面研究表明，血浆中持续低水平的凝血酶可以延缓内皮细胞、足细胞的凋亡，保护肾小球滤过屏障，减轻蛋白尿。分子对接结果显示，黄蜀葵花中的主要活性成分槲皮素-3-O -刺槐糖苷、芦丁、槲皮素-3'-O -葡萄糖苷、银椴苷等与主要靶点（ALB、EGFR、ESR1、PPARG、F2等）的结合活性较强，这在侧面反映了网络预测结果的可靠性。故今后在设计相关基础实验或临床研究时可重点关注槲皮素-3-O -刺槐糖苷、芦丁、槲皮素-3'-O -葡萄糖苷、银椴苷等在干预糖尿病肾病相关机制中的作用。

GO 富集分析结果显示，BP 包括如蛋白质水解、纤维蛋白分解、雌激素应答、MAPK 级联的调控等，主要涉及酶结合、丝氨酸型内肽酶活性、MAP 激酶活性等功能，通过KEGG 富集分析可以判断，黄蜀葵花干预糖尿病肾病的信号通路主要与细胞增殖、分化、免疫、炎症反应相关通路有关，例如TNF 信号通路、催乳素信号通路、FoxO 信号通路、MAPK 信号通路等。炎症反应是糖尿病肾病的一个重要病理生理因素。在KEGG 富集分析中，MAPK 信号通路和TNF 信号通路是富集基因最多的信号通路且与炎症反应密切相关，因此推测MAPK 、TNF 信号通路可能是通过抗炎干预糖尿病肾病的关键通路。p38 MAPK 信号通路是MAPK 家族成员之一，参与调控炎症反应、凋亡、细胞分化等多种生理过程。既往研究表明，促炎症因子白细胞介素（IL ）-10β 、肿瘤坏死因子（TNF ）-α 和IL-6 可以激活p38 MAPK 信号通路促进炎性介质的合成和释放，加重肾组织炎症损伤[48-49] 。多项研究表明黄葵胶囊可通过抑制肾组织p38 MAPK 信号通路活性以及致纤维化细胞因子、炎症因子蛋白表达水平, 改善糖尿病肾病大鼠肾纤维化[50-52] 。FoxO 信号通路是体内调控细胞增殖、氧化应激、细胞凋亡和免疫反应等重要通路，其关键转录因子叉头框转录因子O1 （FoxO1 ）在肾脏病发病机制中发挥重要作用。研究发现，FoxO1 活化可抑制高糖诱导的足细胞上皮–间充质细胞转化进而减轻肾组织纤维化[53] 。由此可以推测TNF 信号通路、MAPK 信号通路、FoxO 信号通路等在黄蜀葵花干预糖尿病肾病过程中发挥重要作用。

本研究采用网络药理学的研究方法，对黄蜀葵花多成分、多靶点、多信号通路干预糖尿病肾病的药理机制进行了系统研究。黄蜀葵花可能通过ALB 、EGFR 、ESR1 、CASP3 、PPARG 等靶点作用于TNF 、FoxO 、MAPK 等多条信号通路发挥作用，为黄蜀葵花的进一步研究提供了基础和参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：陈学麟，胡剑卓，陶灵霞．基于网络药理学和分子对接的黄蜀葵花干预糖尿病肾病的作用机制研究 [J]. 现代药物与临床, 2022, 37(2): 252-263 .

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