肇庆地区砂糖橘黄龙病的两种分子检测方法对比研究
肇庆地区砂糖橘黄龙病的两种分子检测方法对比研究
【摘要】：柑橘黄龙病又称黄梢病或黄枯病,是柑橘生产上的毁灭性病害。肇庆、云浮市是砂糖橘最大的主产区,为了了解砂糖橘主产区柑橘黄龙病发生和危害情况,建立适合于本地区快速、准确的柑橘黄龙病的检测方法,作者以砂糖橘叶脉为材料,采用微量提取法提取DNA,利用柑橘黄龙病病原的特异引物对其16S rDNA片段进行PCR扩增,将其扩增产物纯化、回收,筛选含有黄龙病病原16S rDNA片段的阳性克隆进行序列测定,初步建立了适用于肇庆、云浮地区砂糖橘黄龙病常规PCR检测技术,同时初步建立了砂糖橘荧光定量PCR法检测方法,荧光荧光定量PCR(探针法)由华南农业大学提供含有柑橘黄龙病病菌的片段的质粒的大肠杆菌,将质粒进行复苏、扩大培养,提取质粒(作为阳性对照),并应用此方法对肇庆、云浮地区35个柑橘园疑似HLB样品226个进行了检测;结果表明:本研究在病原DNA片段的序列比对中,砂糖橘黄龙病病原的序列与亚洲黄龙病病原(Liberobacterasiatieum)序列同源性达到99%(仅在177、325、357 bp碱基有差异),说明砂糖橘黄龙病病原是L.asiaticum的1种;两种检测方法比较,Taq探针荧光定量PCR比常规PCR灵敏度高,受试的35个果园226份样品中,常规PCR检测出柑橘黄龙病共18份,所占比率达到8%,检测出黄龙病果园有11个,所占比例达到31%;TaqMan探针荧光定量PCR检测出柑橘黄龙病共4l份,所占比例达18%,检测出黄龙病的果园有21个,所占比例达到60%。因此,荧光定量PCR方法能更好地为该产区砂糖橘黄龙病的病害提供准确、快速的检测。
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