首页 > 分享 > 一种三七花多糖RN0D及其制备方法和用途

一种三七花多糖RN0D及其制备方法和用途

花匠小妙招
2025-01-17 15:23

技术领域

本发明属于多糖提取和应用技术领域，具体涉及一种从三七花(flowers ofPanax Notoginseng(BurK.)F.H.Chen)中提取三七花多糖RN0D的方法、采用该方法提取的三七花多糖RN0D和该三七花多糖RN0D在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

癌症是一个重大全球健康问题，国际癌症研究机构(IARC)2020年全球癌症负担的数据显示，2020年全球有1929万新的癌症病例，导致996万人死亡，预计2040年将有2840万新的癌症病例，这一数字预计将上升47％。鉴于癌症诊断的预期增长，尽快找到有效的抗癌治疗方案是至关重要的。胰腺癌因其侵袭性和不良预后，有"癌症之王"的称号。胰腺癌在世界卫生组织第五版人类癌症分类中被分为良性上皮肿瘤和前体、恶性上皮肿瘤和胰腺神经内分泌肿瘤等，胰腺导管腺癌(PDAC)约占胰腺癌的90％，其5年生存率不到10％，是最难治愈的恶性肿瘤之一。虽然手术是主要的治疗选择，但不幸的是，即使在手术后，大多数病例都是晚期，5年生存率不到20％。而放疗和化疗可能提高早期癌症患者的生存率，辅助化疗已被证明可以小幅提高生存率，但它也有很大的副作用。因此，需要创新和有效的治疗方法来改善PDAC患者病情。

三七是一种著名的中国传统药材，其干燥的花朵(FPN)也被广泛应用。研究表明，FPN含有多种生物活性物质，如皂甙、黄酮类、挥发油和多糖等，具有抗高血压、抗癌、保肝和保护心血管等特性。近年来，人们对从FPN中提取的活性成分及其生物活性作用给予了很大重视。此前，发明人从FPN中纯化并鉴定了一种名为RN1的阿拉伯半乳聚糖(专利CN104710538B)，并展现出良好的抗胰腺癌活性。而来自天然植物的多糖在成分和种类上具有微观不均一性，即便在同一种植物中仍存在结构差异的多糖组分，这些结构上的差异进而影响了其生物活性，究其原因，可以部分归因于使用不同的提取和纯化方法。基于此，发明人尝试探索不同提取纯化方法，旨在从三七花中开发出更多的不同结构的具有良好抗肿瘤活性尤其是抗PDAC活性的多糖物质。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种三七花多糖RN0D，是从三七花中提取得到的一种结构新颖的中性多糖，显示良好的抗肿瘤活性特别是抗胰腺癌活性。药理实验表明所述多糖在细胞水平上可显著抑制肿瘤细胞(实例为胰腺癌肿瘤细胞)的增殖及癌细胞克隆，并且体内外实验结果也表明该多糖可发挥抗癌活性，这表明三七花多糖RN0D具有良好的抗肿瘤作用，有望成为治疗肿瘤的潜在多糖药物。

具体的，所述三七花多糖RN0D的重均分子量为10～500kDa，相对分子质量为16.7kDa。其主要由葡萄糖和半乳糖组成，含有39.19wt％的半乳糖、43.1wt％的葡萄糖、10.96wt％的阿拉伯糖和6.75wt％的木糖。

进一步的，三七花多糖RN0D的红外图谱如图1所示，存在以下吸收峰：3295cm

进一步的，三七花多糖RN0D的

本发明的目的之二是提供上述三七花多糖RN0D的制备方法，具体包括以下步骤：

a.多糖提取：将干燥的三七花进行乙醇脱脂、水提、过滤，将所得滤液浓缩，透析、再浓缩、醇沉、离心、真空干燥，再经过去蛋白后冷冻干燥得水提三七花粗多糖；

b.多糖纯化：将所述水提三七花粗多糖用DEAE纤维素阴离子柱进行分级纯化，用蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚检测，收集蒸馏水洗脱组分，得纯化三七花多糖RN0；用淀粉酶来去除RN0中的淀粉，然后将淀粉酶灭活并透析、浓缩，经冷冻干燥后得三七花多糖RN0D。

优选的，所述三七花多糖RN0D的制备方法包括以下步骤：

a.多糖提取：首先，将干燥的三七花在95％乙醇中浸泡1周，然后风干，加入20倍重量的去离子水，100℃下提取，过滤，残渣再次用去离子水提取，如此反复提取3次，每次3h，浓缩合并后的上清液，用15％的三氯乙酸在4℃处理3h，以去除蛋白质，离心，浓缩，透析，再浓缩，加入3倍于浓缩液体积的95％乙醇，离心得沉淀，沉淀经洗涤和真空干燥后再用15％的三氯乙酸在4℃处理3h，以去除蛋白质，最后再冷冻干燥得水提三七花粗多糖；所述透析的透析袋的截留分子量为3500Da；

b.多糖纯化：取三七花粗多糖，加入10倍重量的水中溶解，离心，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱进行分离，用蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥得所述三七花多糖RN0；用淀粉酶来去除RN0中的淀粉，然后将淀粉酶灭活并透析、浓缩，经冷冻干燥后得三七花多糖RN0D。

本发明的目的之三是提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的作为活性成分的上述三七花多糖RN0D，该组合物可以进一步包括药剂学上可接受的药物辅料，例如载体、赋形剂、佐剂和/或稀释剂等。

本发明的目的之四是提供上述三七花多糖RN0D或含有其的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。所述的肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物。本发明筛选了11种常见肿瘤包括食道鳞状细胞癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺导管腺癌和胰腺神经内分泌肿瘤，发现三七花多糖RN0D对这些肿瘤细胞均具有明显抑制增殖作用，特别是针对胰腺导管腺癌(PDAC)和胰腺神经内分泌肿瘤(PNEN)两种胰腺肿瘤。

在应用时，所述的三七花多糖RN0D可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药，特别是与其他用于预防或治疗肿瘤或癌症药物组合。所述的治疗剂包括但不限于：氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、塞替派、卡莫司汀、司莫司汀、白消安、顺铂、卡铂、草酸铂、丝裂霉素。

本发明具有以下有益效果：

本发明开发出了简单有效的多糖提取纯化方法，以三七花为原料获得了一种新型的功能性三七花多糖RN0D。经实验验证，本发明的三七花多糖RN0D可以通过体外抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞克隆能力、体内抑制裸鼠移植瘤生长，从而起到抑制肿瘤的功效。本发明的三七花多糖RN0D对多种肿瘤尤其是PDAC和PNEN两种胰腺肿瘤具有明显抑制增殖作用，具有开发新型抗肿瘤糖类药物的潜在应用价值。

附图说明

图1为实施例1制备的三七花多糖RN0D的IR谱图；

图2为实施例1制备的三七花多糖RN0D的

图3为实施例2中三七花多糖RN0D对多种癌细胞以及人正常细胞生长抑制作用随浓度变化的示意图；

图4：实施例2中三七花多糖RN0D对类器官胰腺癌肿瘤(PNEN和PDAC)生长抑制作用的示意图，其中A为培养7天后的细胞活力，B为培养7天后的细胞直径；

图5为实施例2中三七花多糖RN0D对人恶性黑色素瘤细胞A375、人非小细胞肺癌A549、人胰腺癌细胞株PANC-1和QGP-1平板克隆形成抑制作用的示意图；

图6为实施例3中三七花多糖RN0D对裸鼠移植瘤的抑制作用的示意图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1：三七花多糖RN0D的制备

a.多糖提取：

将干燥的三七花用95％的乙醇脱脂一周(乙醇每3天更换一次)，然后室温自然干燥。将干燥后的三七花1000g用沸水(去离子水)20升提取3次，每次3h。经硫酸-苯酚检测至无明显反应，过滤，将每次的提取液合并后加热浓缩，用截留分子量为3500Da的透析袋透析，再浓缩至2升，再在搅拌下加入3倍体积6升的95％乙醇，静置过夜。倾去上清液，离心分离，所得沉淀用3倍体积的无水乙醇洗涤，离心分离，沉淀经真空干燥后再用15％的三氯乙酸在4℃处理3h，以去除蛋白质，最后置-40℃下真空冷冻干燥，得水提三七花粗多糖100g。

b.多糖纯化：

取上述制备的三七花粗多糖10g，100mL水溶解，离心除去不溶物，上清液通过Cl-型DEAE-纤维素阴离子柱进行初步分级纯化。用蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并蒸馏水洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥得三七花多糖RN0 0.9g。在进一步纯化之前，用淀粉酶来去除淀粉，即将淀粉酶加入到RN0的水溶液中，加热去除淀粉；然后将淀粉酶灭活并透析、浓缩，经冷冻干燥后得所述三七花多糖RN0D。

c.多糖结构鉴定与解析：

采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)进行分子量测定，高效凝胶渗透色谱采用UltrahydrogelTM 2000(25cm×0.75cm，美国Waters公司)、UltrahydrogelTM 500(25cm×0.75cm，美国Waters公司)串联柱，以用不同分子量的T-系列标准葡聚糖(Dextran)制作标准曲线。经高效凝胶渗透色谱法分析表明，多糖RN0D的重均分子量为10～500kDa，相对分子量为16.7kDa。

采用PMP-柱前衍生高效液相色谱法进行单糖组成分析，即将多糖完全水解、PMP衍生、氯仿萃取、上层水相送入HPLC分析，HPLC采用Agilent 1260Seri高效液相系统测定(美国Agilent公司)、TSKgel GMPWXL色谱柱(7.5×300mm)、TSKgel保护柱(6.0×40mm，12μm，购自日本TOSOH公司)、BDS HYPESIL C18色谱柱(250×4.60mm，6μm，购自Thermo)。单糖组成分析结果显示，三七花多糖RN0D含有39.19wt％的半乳糖、43.1wt％的葡萄糖、10.96wt％的阿拉伯糖和6.75wt％的木糖。

对三七花多糖RN0D进行红外分析，红外分析采用Perkin-Elmer 599B型红外分光光度计测定(美国Perkin-Elmer公司)。多糖RN0D的红外图谱如图1所示，3295cm

对三七花多糖RN0D进行核磁共振分析，核磁共振分析采用BruckerAM-500型核磁共振仪测定(德国Brucker公司)。多糖RN0D的

实施例2：三七花多糖RN0D抑制肿瘤活性

①CCK8实验

实验采用人前列腺癌细胞LNCaP、人肝癌细胞HepG2、人恶性黑色素瘤细胞A375、人非小细胞肺癌A549、人食管鳞癌细胞KYSE-150、人舌鳞癌细胞CAL27、人结肠癌细胞HT-29、人卵巢癌细胞株Caov-3、人乳腺癌细胞MCF-7、人胰腺癌细胞株PANC-1(American TypeCulture Collection，Rockville，USA)和QGP-1以及人正常永生化表皮细胞Hacat、人正常脐静脉内皮细胞HUVEC(Cobioer公司，南京，中国)、人正常肝细胞株LO2、人正常脑微血管内皮细胞HCMEC-D3和人正常肠上皮细胞HIEC(明州生物公司，宁波，中国)，将这些细胞加入到含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素(Beyotime Biotechnology，上海，中国)的DMEM或1640培养基(Solaibao，北京，中国)中，于37℃含5％CO

接种细胞取对数生长期细胞，胰酶消化，用培养基制成单细胞悬液后计数，以2000-5000个细胞/孔接种于96孔培养板，另外设空白对照孔，只加完全培养基。在37℃、含5％CO

②PDO评估RN0D抗增殖实验

众所周知，实体瘤对化疗药物的反应不如培养的细胞单层，为了更好地模拟微环境和预测治疗反应，研究人员经常转向病人类器官(PDO)。在这项研究中，我们使用来自胰腺导管腺癌(PDAC)和胰腺神经内分泌肿瘤(PNEN)的PDO来评估RN0D的抗增殖作用。我们测量了PDO的直径和细胞活力，如图4所示，可以看出，在用RN0D培养7天后，两者都有减少。

③平板克隆形成实验

取对数生长期的细胞，胰酶消化并吹打成单个细胞，用培养基制成单细胞悬液后计数。将PANC-1细胞(100细胞/孔)、QGP-1细胞(300细胞/孔)、A549细胞(150细胞/孔)和A375细胞(200细胞/孔)接种在6孔板中，轻轻转动，使细胞分散均匀，加入三七花多糖RN0D处理，使其最终浓度为0μg/mL，50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，400μg/mL和800μg/mL。置于37℃、5％CO

平板克隆形成实验结果如图5所示，可以看出，三七花多糖RN0D能够抑制这四种细胞的克隆形成尤其是胰腺癌细胞，PANC-1和QGP-1细胞与不同浓度三七花多糖RN0D共孵育两周，平板克隆实验结果显示三七花多糖RN0D能明显抑制胰腺癌细胞克隆数量以及克隆大小。

这些实验结果表明，三七花多糖RN0D在体外表现出抗癌特性，特别是针对PDAC和PNEN两种胰腺肿瘤。

实施例3：三七花多糖RN0D抑制裸鼠移植瘤活性

胰腺癌患者来源的裸鼠移植瘤实验

实验用雌性BALB/c nu/nu小鼠(6-8周龄，体重18-20g，购自GempharmatechBiotechnology，Nanjing，China)，在上海长征医院实验动物中心，恒温(24-26℃)、Specific Pathogen Free(SPF)条件下饲养，笼具、垫料、饮水及饲料均做高压和紫外线消毒处理，无菌操作，所有的小鼠程序都是根据美国国家卫生研究院的实验动物护理和使用指南进行的，该方案得到了上海长征医院动物伦理委员会的批准。胰腺癌组织，包括胰腺导管腺癌(PDAC)和胰腺神经内分泌肿瘤(PNEN)，来自上海长征医院接受手术切除的患者。本研究得到了上海长征医院研究伦理委员会的批准。在获取所有患者的组织之前，都获得了书面的知情同意。经病理学家评估，样本被确认为胰腺肿瘤。

将肿瘤组织在高浓度的MatrigelTM基底膜基质(BD Biosciences，FranklinLakes，USA)中剁成约4mm

随后，使用PDAC PDX模型评估了RN0D对肿瘤进展的影响。在这项研究中，PDAC PDX模型被随机分配到三组：PBS、10mg/kg RN0D治疗和20mg/kg RN0D治疗，每组包括10个模型。每4天腹腔注射一次PBS或RN0D，并在相同的时间间隔内测量体重和肿瘤生长，直到达到终点。治疗36天后，每组的4只小鼠被杀死，并收获其皮下肿瘤并称重。每只小鼠的内脏都被采摘下来进行染色，并采血进行生化测试，同时观察每组其余6只小鼠的肿瘤生长和生存情况。实验期间每4天测量一次动物体重和肿瘤大小，直到肿瘤超过2000mm

研究结果如图6所示，可以看出，使用RN0D有效地阻碍了胰腺癌在体内的生长。具体的，肿瘤的生长曲线表明，与基线肿瘤体积相比，用10mg/kg RN0D治疗的小鼠平均肿瘤体积增加了4.31倍，20mg/kg RN0D增加了2.87倍，而PBS增加了9.87倍；治疗36天后，10mg/kgRN0D和20mg/kg RN0D组的肿瘤生长分别减少51.01％和64.24％(图6A-C)。RN0D治疗以浓度依赖的方式抑制了肿瘤的重量，其中20mg/kg RN0D组的抑制率最高，为62.13％(图6D)。此外，该治疗明显延长了PDAC的PDX模型的生存期，治疗80天后，PBS组的存活率为0％，而10mg/kg RN0D组和20mg/kg RN0D组的存活率分别为66.67％和83.33％(图6E)。

本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变，只要在本发明权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。