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球孢白僵菌孢子

花匠小妙招
2024-09-17 16:05

球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药、制备方法及应用

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于仿生矿化技术构建的一种球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药、制备方法及其在玉米螟防治中的应用。

背景技术：

生物农药是指利用生物活体(如真菌、细菌、昆虫病毒、转基因生物、天敌等)或其代谢产物(如信息素、生长素、萘乙酸钠等)针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂。生物农药相较于传统的化学农药，其具有选择性强、安全性高的优势，其对生态环境影响小的同时可以诱发害虫患病。大力发展生物农药对经济可持续发展、环境友好型社会建设、减轻化学农药对生态的压力等，均具有重要的战略意义。传统生物农药主要通过活性物质的直接喷洒发挥作用，其弊端在于受外界影响大、不易保存、作用时间短。有机无机杂化纳米花是由戈钧团队(gej.,leij.,zarer.protein-inorganichybridnanoflowers[j].nat.nanotechnol.2012,7(7):428.)于2012年发现，在含有蛋白(有机配体)的磷酸盐缓冲液中，加入硫酸铜，蛋白骨架上的酰胺基与铜离子配位形成络合结构的初级磷酸盐晶体，并在晶体表面各个位点进行异向生长所形成的花型结构。与传统的生物农药相比，以杂化纳米花为基质所构建的纳米农药，具有合成过程简单、给药后可以长效释放、有利于长期保存等优点，应用前景广阔。白僵菌是一种子囊类的虫生真菌，常通过无性繁殖生成分生孢子，菌丝有横隔有分枝。白僵菌可以侵入6个目15个科200多种昆虫、螨类的虫体内大量繁殖，同时产生白僵素(非核糖体多肽类毒素)、卵孢霉素(苯醌类毒素)和草酸钙结晶，这些物质可引起昆虫中毒，打乱昆虫新陈代谢以致死亡。近年来，白僵菌作为生物农药，其无农残、无抗性、再生长性、高选择性的优良性质，在田间害虫的防治中得到了广泛的应用。本专利采用吉林省农业科学院提供的白僵菌高孢粉(公众可以购买得到)作为孢子来源，具有良好的稳定性，萌发率在90％以上。

虽然白僵菌孢子具有上述诸多优点，但是其在农业应用中依然有很大的优化潜力，例如其疏水特性使其在水中分散能力较差，大田使用时用量较大，同时不容易储存。对孢子进行仿生矿化是对孢子性能进行优化的一条有效途径，其能赋予孢子良好的室温下长期储存能力、缓释释放能力以及良好的水相中分散性。其中，杂化纳米花矿化材料由于具有良好的疏水性、均一适中的粒径大小、简单易操作的合成方式等优点，有望成为白僵菌孢子矿化的重要材料。以杂化纳米花为基质的孢子矿化策略，能够最大限度地延长孢子储存周期和使用时释放时间，进而延长其发挥作用时间，达到良好的作用效果。

技术实现要素：

本发明的目的是基于仿生矿化技术提供一种球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药、制备方法及其在玉米螟防治中的应用。

本发明通过仿生矿化的策略，将球孢白僵菌孢子担载进杂化纳米花材料中，构建了球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药。孢子萌发活性检测显示，球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药脱壳后，孢子依然具有良好的萌发活性，能够有效杀灭玉米螟。

本发明所述的一种球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药的制备方法，其特征在于：将球孢白僵菌孢子均匀分散于含有吐温-20的磷酸盐缓冲液(1×，ph＝7.4)中，再加入1ml、30mg/ml硫酸铜水溶液混合均匀，室温下反应24～96h；反应完毕后，反应体系经5000～10000r/min离心5～15min，收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤，-60～-40℃冻干后获得球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药(spore@nanoflower)。

磷酸盐缓冲液的用量为15～30ml，在磷酸盐缓冲液中球孢白僵菌孢子的浓度为0.2～1.0mg/ml，硫酸铜与球孢白僵菌孢子质量比为5～10：1，吐温-20的用量为20～40μl。

球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药的脱壳处理过程即将包封球孢白僵菌孢子的磷酸盐晶体裂解，使球孢白僵菌孢子得以重新暴露，其过程如下：将球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药(1～10mg)在1ml、1m的edta·na2溶液中室温下混匀静置20～40min，混合均匀即得到分散良好的球孢白僵菌孢子悬浊液；将该球孢白僵菌孢子悬浊液搅拌于玉米螟饲料中进行喂养，可以实现对玉米螟的灭杀。

本发明所制备的球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药具有如下优点：绿色环保，给药过程造成的环境污染少；结构疏水性强，保存条件要求低，利于长期保存；能够实现孢子的高效担载及长效释放。同时，所构建的球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药能够在1medta·na2溶液中实现脱壳处理，形成悬浊液后作为农药进行玉米螟的杀灭，对喷洒人员无免疫原性，不引起过敏症状。

综上，本发明基于仿生矿化的策略，以球孢白僵菌孢子为有机配体，构建球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药。通过实施例1和实施例2中的仿生矿化技术进行球孢白僵菌孢子的固载，以该球孢白僵菌孢子-杂化纳米花为生物农药，进行玉米螟的杀灭。在该体系中，生物农药能够在简易环境中长期储存，储存成本大幅降低，同时可以实现球孢白僵菌孢子的缓慢释放，延长作用时间，降低喷洒时药量。此外，球孢白僵菌孢子的包封也避免了操作人员与孢子的直接接触，降低了过敏风险。本发明专利，优化了球孢白僵菌孢子使用过程中的各种短板，有望成为未来球孢白僵菌孢子作为生物农药广泛使用的一种新型技术手段，有助于为农业中球孢白僵菌孢子的利用节约各项成本，成为一类环境及经济友好的生物农药。

附图说明

图1：实施例1合成的spore@nanoflower的扫描电镜结果。

图2：实施例2合成的spore@nanoflower的扫描电镜结果。

图3：实施例4合成的spore@nanoflower的荧光显微镜结果。图(a)为spore@nanoflower明场，图(b)为spore@nanoflower中gfp荧光激发，图(c)为spore@nanoflower明场与荧光的共定位。

图4：实施例1中合成spore@nanoflower储存三个月后的扫描电镜结果。图(a)为刚合成的spore@nanoflower的扫描电镜图，图(b)为室温中保存三个月的spore@nanoflower的扫描电镜图。

图5：实施例1合成的spore@nanoflower的元素分析结果。图(a)为spore@nanoflower中各元素的比例图，图(b)spore@nanoflower中各元素的分布图。

图6：实施例1合成的spore@nanoflower的x射线衍射结果。曲线(1)cu3(po4)2的x射线衍射结果，曲线(2)spore@nanoflower的x射线衍射结果。

图7：实施例1合成的spore@nanoflower和游离球孢白僵菌孢子的傅立叶红外变换光谱结果。曲线(1)cu3(po4)2的傅立叶红外变换光谱结果，曲线(2)spore的傅立叶红外变换光谱结果，曲线(3)spore@nanoflower的傅立叶红外变换光谱结果。

图8：实施例1合成的spore@nanoflower的热重曲线分析。曲线(1)cu3(po4)2的热失重曲线，曲线(2)spore@nanoflower的热失重曲线。

图9：实施例1合成的spore@nanoflower和游离球孢白僵菌孢子的半数致死浓度(lc50值)对比图。

图10：实施例1合成的spore@nanoflower和球孢白僵菌孢子在药物浓度300μg/g时的半数致死时间(lt50值)对比图。

具体实施方式

下面给出的实施例子是对本发明作进一步说明，以便于本专业技术人员更全面地理解本发明。但所给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，因而该专业的技术人员根据上述发明内容所做出的非本质的改进和调整也应属于本发明保护范围。

实施例1

将5mg的球孢白僵菌孢子均匀分散于含有40μl吐温-20的20ml磷酸盐缓冲液中，得到球孢白僵菌孢子悬液；然后将30mg硫酸铜溶于1ml蒸馏水，将配制好的硫酸铜溶液加入到球孢白僵菌孢子悬液中混合均匀，室温下反应96h。反应完毕后，体系经8000r/min离心5min，收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤三次，-50℃冻干后获得球孢白僵菌孢子-杂化纳米花(杂化纳米花即通过球孢白僵菌孢子(有机配体)与铜离子(金属离子)配位并异向生长所得的花形结构，所以叫做杂化纳米花)生物农药spore@nanoflower，产量为24mg。

从图1的扫描电镜发现，采用上述方法制备的球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药spore@nanoflower形貌规整，其粒径在20～30μm之间。

实施例2

将20mg的球孢白僵菌孢子均匀分散于含有40μl吐温-20的20ml磷酸盐缓冲液中，得到球孢白僵菌孢子悬液；然后将30mg硫酸铜溶于1ml蒸馏水，将配制好的硫酸铜溶液加入到球孢白僵菌孢子悬液中混合均匀，室温下反应96h。反应完毕后，体系经8000r/min离心5min，收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤三次，-50℃冻干后获得球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药spore@nanoflower，产量为36mg。

从图2的扫描电镜发现，采用上述方法制备的球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药spore@nanoflower形貌规整，其粒径在5～20μm之间。

实施例3

取30mg硫酸铜溶于1ml蒸馏水，将配制好的硫酸铜溶液加入到20ml磷酸盐缓冲液中混合均匀，室温下反应96h。反应完毕后，体系经8000r/min离心5min，收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤三次，-50℃冻干后获得不担载球孢白僵菌孢子的杂化纳米花cu3(po4)2(nanoflower)，产量为30mg。

实施例4

将5mg由吉林省农业科学院提供的表达绿色荧光蛋白(gfp)的球孢白僵菌孢子(本实验中所有孢子均为吉林省农业科学院提供)均匀分散于含有40μl吐温-20的20ml磷酸盐缓冲液中，得到球孢白僵菌孢子悬液；然后将30mg硫酸铜溶于1ml蒸馏水，将配制好的硫酸铜溶液加入到球孢白僵菌孢子悬液中混合均匀，室温下反应96h。反应完毕后，体系经8000r/min离心5min，收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤三次，-50℃冻干后获得球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药spore@nanoflower，产量为24mg。

从图3的荧光显微镜表征发现，采用上述方法制备的球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药spore-gfp@nanoflower，gfp荧光与纳米花存在共定位。

实施例5

将实施例1和实施例3中的不担载球孢白僵菌孢子的杂化纳米花cu3(po4)2(nanoflower)、球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药spore@nanoflower和室温下保存三个月的spore@nanoflower冻干样品用水溶解，滴在硅片上，晾干，使用xl-30esemfeg扫描电镜拍摄其形貌，并通过mapping分析元素组成，发现其元素分布均匀，且含有硫、碳等元素，证明了球孢白僵菌孢子的成功担载，结果如图4和5所示。使用brukerd8advancex-线衍射仪测定cu3(po4)2和spore@nanoflower的晶体结构，射线源为cu-kα加速电压为50kv，扫描范围为2θ＝5°～45°，结果如图6所示，显示了spore@nanoflower各衍射峰的位置和相对强度与cu3(po4)2一致，表明生物农药spore@nanoflower与cu3(po4)2具有一致的晶型。使用brukerv70测定傅立叶变换红外光谱(ft-ir)，测量波数范围为600～4000cm-1，结果如图7所示。cu3(po4)2和spore@nanoflower在556、1053和1150cm-1处产生了p-o键的振动，球孢白僵菌孢子和spore@nanoflower在1650cm-1产生酰胺i带振动，在2815cm-1处产生了c-h伸缩振动，证明球孢白僵菌孢子成功担载进杂化纳米花中。同时，没有发现新的峰出现和明显的峰移动，表明球孢白僵菌孢子在杂化纳米花材料中的担载，是通过基于仿生矿化的自组装模式形成的，没有共价键的形成。

实施例6

将实施例1和实施例3合成的cu3(po4)2(nanoflower)和spore@nanoflower充分干燥后进行热重分析，使用taq500检测仪器在氮气环境中以10℃/min的速率进行升温，所获得的热重曲线如图8所示。

从图8可以发现，spore@nanoflower在200～500℃有明显的失重，比cu3(po4)2的失重量高30％左右，该部分失重即球孢白僵菌孢子在生物农药中所占的含量。根据热重曲线，计算spore@nanoflower中球孢白僵菌孢子的质量担载量为30％。

实施例7

将实施例1中合成的spore@nanoflower样品和球孢白僵菌孢子spore样品分别设置0、50、150、300、500μg/g的6个浓度为一个大组，并设置三组平行样本，一共六个组别，将称量好的样品与人工饲料混合(spore@nanoflower与饲料混合前需与edta·na2溶液预先混合)。分别在不同浓度组别中饲喂20头一日龄玉米螟幼虫，每天记录死虫数量，在死虫过半时停止记录。用上述六组数据分别求得一元二次回归方程，spore@nanoflower回归方程分别为y＝(0.1292x+25.742)/100、y＝(0.1313x+23.732)/100、y＝(0.138x+23.502)/100，球孢白僵菌孢子spore回归方程分别为y＝(0.0861x+19.617)/100、y＝(0.1044x+14.68)/100、y＝(0.1061x+16.566)/100，其中y为死亡率，x为用药浓度。并分别计算每个方程对应半数致死浓度，分别为187.76、200.02、192.01、352.88、338.31、315.12μg/g；分别计算三组spore@nanoflower和三组球孢白僵菌孢子spore半数致死浓度的平均数，其结果为193.26μg/g和335.44μg/g，为方便比较起抗虫活性，以两组结果绘制柱状图，如图9所示。证明经无机杂化纳米花包封的孢子，其抗虫活性有显著提升，球孢白僵菌孢子-无机杂化纳米花生物农药体系是一种极具应用潜力的微生物杀虫剂新剂型。

实施例7

按300μg/g浓度分别将spore@nanoflower样品和球孢白僵菌孢子样品与人工饲料混合，并设置三组平行样，记录其半数致死所用时间。用上述六组数据分别求得一元二次回归方程，spore@nanoflower回归方程分别为y＝(8.3435x+13.999)/100、y＝(7.8835x+12.654)/100、y＝(8.2096x+8.7569)/100，球孢白僵菌孢子spore回归方程分别为y＝(6.3653x+12.155)/100、y＝(5.7895x+14.698)/100、y＝(7.9735x+3.505)/100，其中y为死亡率，x为给药时间。并分别计算每个方程对应半数致死时间，分别为4.31、4.74、5.02、5.95、6.10、5.83d，并分别计算三组spore@nanoflower和三组孢子spore半数致死时间的平均数，其结果为4.69d(天)和5.83d，为方便比较起抗虫活性，以两组结果绘制柱状图，如图10所示。证明经无机杂化纳米花包封的孢子，其抗虫活性有显著提升，球孢白僵菌孢子-无机杂化纳米花生物农药体系是一种极具应用潜力的微生物杀虫剂新剂型。

技术特征：

1.一种球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药的制备方法，其特征在于：将球孢白僵菌孢子均匀分散于含有吐温-20的磷酸盐缓冲液(1×，ph＝7.4)中，再加入硫酸铜水溶液混合均匀，室温下反应24～96h；反应完毕后，反应体系经5000～10000r/min离心5～15min，收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤，-60～-40℃冻干后获得球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药。

2.如权利要求1所述的一种球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药的制备方法，其特征在于：吐温-20的用量为20～40μl，磷酸盐缓冲液的用量为15～30ml，在磷酸盐缓冲液中球孢白僵菌孢子的浓度为0.2～1.0mg/ml，硫酸铜与球孢白僵菌孢子质量比为5～10：1；硫酸铜水溶液的体积用量为1ml，浓度为30mg/ml。

3.一种球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药，其特征在于：是由权利要求1或2所述的方法制备得到。

4.如权利要求3所述的一种球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药，其特征在于：球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药中，球孢白僵菌孢子的质量担载量为30％。

5.如权利要求3所述的一种球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药，其特征在于：球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药对玉米螟幼虫的半数致死浓度为193.26μg/g，半数致死时间为4.69d。

6.权利要求3～5任何一项所述的球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药在玉米螟防治中的应用。

7.如权利要求6所述的球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药在玉米螟防治中的应用，其特征在于：将1～10mg球孢白僵菌孢子-杂化纳米花生物农药在1ml、1m的edta·na2溶液中室温下混匀静置20～40min，混合均匀得到分散良好的球孢白僵菌孢子悬浊液；将该球孢白僵菌孢子悬浊液搅拌于玉米螟饲料中进行喂养，从而实现对玉米螟的灭杀。

技术总结
一种球孢白僵菌孢子‑杂化纳米花生物农药、制备方法及其在玉米螟防治中的应用，属于生物技术领域。本发明通过仿生矿化的策略，将球孢白僵菌孢子均匀分散于含有吐温‑20的磷酸盐缓冲液中，再加入硫酸铜水溶液混合均匀，室温下反应24～96h；反应完毕后，反应体系经5000～10000r/min离心5～15min，收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤，‑60～‑40℃冻干，球孢白僵菌孢子担载进杂化纳米花材料中，构建了球孢白僵菌孢子‑杂化纳米花生物农药。磷酸盐缓冲液中球孢白僵菌孢子的浓度为0.2～1.0mg/mL，硫酸铜与球孢白僵菌孢子质量比为5～10：1。球孢白僵菌孢子‑杂化纳米花生物农药脱壳后，孢子依然具有良好的萌发活性，能够有效杀灭玉米螟。

技术研发人员：李全顺;史植元;路杨;张正坤;李启云;隋丽;杜茜;赵宇
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2021.05.24
技术公布日：2021.08.13