产雷公藤Abietatrien
本发明专利技术公开了产雷公藤Abietatrien‑14‑ol的重组酵母工程菌。所公开的重组酵母工程菌过表达：牛儿基焦磷酸合成酶编码基因BTS1、FPP合酶的编码基因ERG20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因SmMS、雷公藤二萜合酶编码基因TwTPS9、细胞色素酶的编码基因TwCYP82D274。还可过表达细胞色素P450氧化还原酶编码基因TwCPR3；进一步还可过表达3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、磷酸转酮酶编码基因PK和磷酸转乙酰酶编码基因PTA。本发明专利技术实现了在酵母中生产Abietatrien‑14‑ol。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种用于生产abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌。
技术介绍
1、雷公藤abietatrien-14-ol是雷公藤内酯醇的生物合成中间体，雷公藤(tripterygium wilfordii hook.f.)，卫矛科雷公藤属植物，我国传统的杀虫和药用植物。雷公藤内酯醇，又称雷公藤甲素，是一种松香烷型二萜类活性化合物(lv et al.2019)。具有免疫调节、抗炎和抗癌等药理活性(bazzocchi et al.2017)。对粘虫幼虫有拒食和触杀活性；已开发成商品化杀鼠剂(0.25毫克/千克)颗粒剂。
2、目前，雷公藤内酯醇主要来源于植物提取，然而其在雷公藤植株中含量极低，野生雷公藤的自然资源有限、生长速度慢、活性成分含量低，且雷公藤内酯醇具有多个复杂手性结构导致化学合成困难，严重制约了这类活性物质的广泛应用和产业化开发，需要开发可替代的、可持续的生产方法。
技术实现思路
1、针对现有技术的缺陷与不足，本专利技术提供了一种产雷公藤abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌。
2、为此，本专利技术所提供的重组酵母工程菌过表达：牛儿基焦磷酸合成酶编码基因bts1(gene bank登记号为cp046096.1)、fpp合酶的编码基因erg20(gene bank登记号为cp036479.1)、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因smms(gene bank登记号为xm-057943362.1)、雷公藤二萜合酶编码基
3、可选的方案是，所述牛儿基焦磷酸合成酶编码基因bts1、fpp合酶的编码基因erg20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因smms、雷公藤二萜合酶编码基因twtps9通过表达载体tpip-bts1-erg20-fbat-tef1p-smms-twtps9-tpit-pyx212转入初始酵母菌中，得到重组菌0；将细胞色素酶的编码基因twcyp82d274通过表达载体pgk1p-twcyp82d274-pgk1t-prs425转入重组菌0中得到重组菌1。如实施例工程菌a-1、4。
4、进一步可选的方案是，所述重组酵母工程菌过表达：牛儿基焦磷酸合成酶编码基因bts1、fpp合酶的编码基因erg20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因smms、雷公藤二萜合酶编码基因twtps9、细胞色素酶的编码基因twcyp82d274和细胞色素p450氧化还原酶编码基因twcpr3(gene bank登记号为mf135235.1)。如实施例工程菌a-2、3、5、6。
5、可选的方案是，所述牛儿基焦磷酸合成酶编码基因bts1、fpp合酶的编码基因erg20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因smms、雷公藤二萜合酶编码基因twtps9通过表达载体tpip-bts1-erg20-fbat-tef1p-smms-twtps9-tpit-pyx212转入初始酵母菌中，得到重组菌0；将细胞色素酶的编码基因twcyp82d274通过表达载体pgk1p-twcyp82d274-pgk1t-prs425转入重组菌0中得到重组菌1(如实施例工程菌a-1、4)；
6、所述细胞色素p450氧化还原酶编码基因twcpr3通过表达载体pgk1p-twcpr3-pgk1t-prs423转入重组菌1中，得重组菌21(如实施例工程菌a-2、5)；或者，所述细胞色素酶的编码基因twcyp82d274和细胞色素p450氧化还原酶编码基因twcpr3通过表达载体pgk1p-twcyp82d274-twcpr3-pgk1t-prs425转入重组菌0中，得重组菌22(如实施例工程菌a-3、6)。
7、进一步还可选的方案是，所述重组酵母工程菌过表达：牛儿基焦磷酸合成酶编码基因bts1、fpp合酶的编码基因erg20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因smms、雷公藤二萜合酶编码基因twtps9、细胞色素酶的编码基因twcyp82d274、细胞色素p450氧化还原酶编码基因twcpr3、磷酸转酮酶编码基因pk和磷酸转乙酰酶编码基因pta；所述磷酸转酮酶编码基因pk的序列如seq id no:1所示，所述磷酸转乙酰酶编码基因pta如seq id no:2所示。如实施例工程菌a-7。
8、可选的方案是，所述牛儿基焦磷酸合成酶编码基因bts1、fpp合酶的编码基因erg20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因smms、雷公藤二萜合酶编码基因twtps9通过表达载体tpip-bts1-erg20-fbat-tef1p-smms-twtps9-tpit-pyx212转入初始酵母菌中，得到重组菌1；
9、所述细胞色素p450氧化还原酶编码基因twcpr3通过表达载体pgk1p-twcpr3-pgk1t-prs423转入重组菌1中，得重组菌21；或者，所述细胞色素酶的编码基因twcyp82d274和细胞色素p450氧化还原酶编码基因twcpr3通过表达载体pgk1p-twcyp82d274-twcpr3-pgk1t-prs425转入重组菌0中，得重组菌22；
10、所述pk和pta通过表达载体adh1p-pk-pta-adh1t-prs423转入重组菌22或重组菌23中，得重组菌3(如实施例工程菌a-7)。
11、还可选的方案是，所述重组酵母工程菌过表达：牛儿基焦磷酸合成酶编码基因bts1、fpp合酶的编码基因erg20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因smms、雷公藤二萜合酶编码基因twtps9、细胞色素酶的编码基因twcyp82d274、细胞色素p450氧化还原酶编码基因twcpr3、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶编码基因thmg1(gene bank登记号为cp036475.1)、磷酸转酮酶编码基因pk和磷酸转乙酰酶编码基因pta。如实施例工程菌a-8。
12、可选的方案是，所述牛儿基焦磷酸合成酶编码基因bts1、fpp合酶的编码基因erg20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因smms、雷公藤二萜合酶编码基因twtps9通过表达载体tpip-bts1-erg20-fbat-tef1p-smms-twtps9-tpit-pyx212转入初始酵母菌中，得到重组菌1；
13、所述细胞色素p450氧化还原酶编码基因twcpr3通过表达载体pgk1p-twcpr3-pgk1t-prs423转入重组菌1中，得重组菌21；或者，所述细胞色素酶的编码基因twcyp82d274和细胞色素p450氧化还原酶编码基因twcpr3通过表达载体pgk1p-twcyp82d274-twcpr3-pgk1t-prs425转入重组菌0中，得重组菌22；
14、将所述thmg1、pk和pta通过表达载体pgk1p-thmg1-pgk1t-adh本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产雷公藤Abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，所述重组酵母工程菌过表达：牛儿基焦磷酸合成酶编码基因BTS1、FPP合酶的编码基因ERG20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因SmMS、雷公藤二萜合酶编码基因TwTPS9和细胞色素酶的编码基因TwCYP82D274。
2.根据权利要求1所述的产雷公藤Abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，所述牛儿基焦磷酸合成酶编码基因BTS1、FPP合酶的编码基因ERG20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因SmMS、雷公藤二萜合酶编码基因TwTPS9通过表达载体TPIp-BTS1-ERG20-FBAt-TEF1p-SmMS-TwTPS9-TPIt-pYX212转入初始酵母菌中，得到重组菌0；
3.根据权利要求1所述的产雷公藤Abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，所述重组酵母工程菌过表达：牛儿基焦磷酸合成酶编码基因BTS1、FPP合酶的编码基因ERG20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因SmMS、雷公藤二萜合酶编码基因TwTPS9、细胞色素酶的编码基因
4.根据权利要求3所述的产雷公藤Abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，所述牛儿基焦磷酸合成酶编码基因BTS1、FPP合酶的编码基因ERG20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因SmMS、雷公藤二萜合酶编码基因TwTPS9通过表达载体TPIp-BTS1-ERG20-FBAt-TEF1p-SmMS-TwTPS9-TPIt-pYX212转入初始酵母菌中，得到重组菌0；将细胞色素酶的编码基因TwCYP82D274通过表达载体PGK1p-TwCYP82D274-PGK1t-pRS425转入重组菌0中得到重组菌1；
5.根据权利要求1所述的产雷公藤Abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，所述重组酵母工程菌过表达：牛儿基焦磷酸合成酶编码基因BTS1、FPP合酶的编码基因ERG20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因SmMS、雷公藤二萜合酶编码基因TwTPS9、细胞色素酶的编码基因TwCYP82D274、细胞色素P450氧化还原酶编码基因TwCPR3、磷酸转酮酶编码基因PK和磷酸转乙酰酶编码基因PTA；所述磷酸转酮酶编码基因PK的序列如SEQ ID NO:1所示，所述磷酸转乙酰酶编码基因PTA如SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求5所述的产雷公藤Abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，所述牛儿基焦磷酸合成酶编码基因BTS1、FPP合酶的编码基因ERG20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因SmMS、雷公藤二萜合酶编码基因TwTPS9通过表达载体TPIp-BTS1-ERG20-FBAt-TEF1p-SmMS-TwTPS9-TPIt-pYX212转入初始酵母菌中，得到重组菌1；
7.根据权利要求1所述的产雷公藤Abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，所述重组酵母工程菌过表达：牛儿基焦磷酸合成酶编码基因BTS1、FPP合酶的编码基因ERG20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因SmMS、雷公藤二萜合酶编码基因TwTPS9、细胞色素酶的编码基因TwCYP82D274、细胞色素P450氧化还原酶编码基因TwCPR3、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、磷酸转酮酶编码基因PK和磷酸转乙酰酶编码基因PTA；所述磷酸转酮酶编码基因PK的序列如SEQ ID NO:1所示，所述磷酸转乙酰酶编码基因PTA如SEQ ID NO:2所示。
8.根据权利要求1所述的产雷公藤Abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，所述牛儿基焦磷酸合成酶编码基因BTS1、FPP合酶的编码基因ERG20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因SmMS、雷公藤二萜合酶编码基因TwTPS9通过表达载体TPIp-BTS1-ERG20-FBAt-TEF1p-SmMS-TwTPS9-TPIt-pYX212转入初始酵母菌中，得到重组菌1；
9.根据权利要求1所述的产雷公藤Abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，通过在初始酵母中转入过表达基因获得，所述初始酵母选自WAT11酿酒酵母或INVSc1酿酒酵母。
10.一种生产Abietatrien-14-ol的发酵方法，其特征在于，包括利用权利要求1-9中任一项所述的酵母基因工程菌株发酵培养制备Abietatrien-14-ol。
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【技术特征摘要】
1.一种产雷公藤abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，所述重组酵母工程菌过表达：牛儿基焦磷酸合成酶编码基因bts1、fpp合酶的编码基因erg20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因smms、雷公藤二萜合酶编码基因twtps9和细胞色素酶的编码基因twcyp82d274。
2.根据权利要求1所述的产雷公藤abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，所述牛儿基焦磷酸合成酶编码基因bts1、fpp合酶的编码基因erg20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因smms、雷公藤二萜合酶编码基因twtps9通过表达载体tpip-bts1-erg20-fbat-tef1p-smms-twtps9-tpit-pyx212转入初始酵母菌中，得到重组菌0；
3.根据权利要求1所述的产雷公藤abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，所述重组酵母工程菌过表达：牛儿基焦磷酸合成酶编码基因bts1、fpp合酶的编码基因erg20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因smms、雷公藤二萜合酶编码基因twtps9、细胞色素酶的编码基因twcyp82d274和细胞色素p450氧化还原酶编码基因twcpr3。
4.根据权利要求3所述的产雷公藤abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，所述牛儿基焦磷酸合成酶编码基因bts1、fpp合酶的编码基因erg20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因smms、雷公藤二萜合酶编码基因twtps9通过表达载体tpip-bts1-erg20-fbat-tef1p-smms-twtps9-tpit-pyx212转入初始酵母菌中，得到重组菌0；将细胞色素酶的编码基因twcyp82d274通过表达载体pgk1p-twcyp82d274-pgk1t-prs425转入重组菌0中得到重组菌1；
5.根据权利要求1所述的产雷公藤abietatrien-14-ol的重组酵母工程菌，其特征在于，所述重组酵母工程菌过表达：牛儿基焦磷酸合成酶编码基因bts1、fpp合酶的编码基因erg20、丹参次丹参酮二烯合成酶编码基因smms、雷公藤二萜合酶编码基因twtps9、细胞色素酶的编码基因twcyp82d274、细胞色素p450氧化还原酶编码基因twc...
【专利技术属性】
技术研发人员：祝传书，王晓丽，赵晓敏，张斌，马志卿，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
相关知识
产雷公藤Abietatrien
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网址: 产雷公藤Abietatrien https://m.huajiangbk.com/newsview1735692.html
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