7种鹤形目鸟类性别的分子鉴定

• 花匠小妙招
• 2025-04-17 17:12

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1、 动物学杂志 Chinese Journal of Zoology 2006 41 5 62 67 7 种鹤形目鸟类性别的分子鉴定 田秀华 刘 铸 何相宝 白素英 东北林业大学野生动物资源学院 哈尔滨 150040 哈尔滨北方森林动物园 哈尔滨 150040 国家林业局野生动植物检测中心 哈尔滨 150040 摘要 生境破碎化和非法狩猎已经使很多鸟类陷入了濒危境地 笼养繁殖进行迁地保护及再引入的保 护措施已经具有举足轻重的作用 鸟类性别鉴定对于有效的繁殖至关重要 然而对珍稀濒危鸟类进行 安全 方便和准确的性别鉴定一直是个难题 本文运用 CHD 基因的一对引物 2550F 2718R 对 7 种

2、鹤形 目鸟类 大鸨 Otis tarda 丹顶鹤 Grus japonensis 蓑羽鹤 Anthropoides virgo 灰鹤 G grus 白鹤 G leucogeranus 白头鹤 G monacha 和灰冠鹤 Balearica regulorum 共 48 只鸟 进行了有效的性别鉴定 研 究结果不但对 7 种鹤形目鸟类的笼养繁殖和个体交换起到了指导作用 而且为今后的再引入提供了有 利条件 本研究的性别分子鉴定方法适用于 7种鹤形目鸟类 具有安全 方便 准确等特点 并且可以推 广使用 关键词 鹤形目 性别鉴定 CHD 基因 中图分类号 Q75 文献标识码 A 文章编号 0250 3

3、263 2006 05 62 06 The Molecular Sexing of 7 Species of Gruiformes TIAN Xiu Hua LIU Zhu HE Xiang Bao BAI Su Ying College of Wild Life Resources Northeast Forestry University Harbin 150040 Harbin North Forest Zoo Harbin 150040 Center for Wild Fauna and Flora National Bureau of Forestry Administration

4、Harbin 150040 China Abstract Fragmented geographical distribution and illegal hunting have lead to endangered status of many bird spe cies Breeding programs in captivity and reintroductionof birds to their habitats are important for protecting endangered species Thus it is important to identify the

5、bird sex in order to make couples that canproduce fertile eggs Currently it is difficult to identify the bird sex by a safe convenient and accurate method Sexes of 48 birds from 7 species of Gruiformes Great Bustard Otis tarda Red crowned Crane Grus japonensis Demoiselle Crane Anthropoides vir go Co

6、mmon Crane G grus Siberian White Crane G leucogeranus Hooded Crane G monacha Grey Crowned Crane Balearica regulorum have been identified by primer 2550F 2718R CHD gene This research not only makes breeding programs in captivity possible but also will offer assistance for reintroduction of birds back

7、 to their habitats in the future Thismethod has shown its advantage as a safe convenient and accurate method for bird sexing Key words Gruiformes Sexing CHD gene 基金项目 黑龙江省科技攻关项目 No GC04B519 第一作者介绍 田秀华 女 硕士 研究方向 鸟类饲养繁殖及 保护生物学研究 E mail tianxiu hua 163 com 收稿日期 2006 03 20 修回日期 2006 04 27 生境破碎化和非法狩猎已经使很

8、多鸟类陷 入了濒危境地 因此在鸟类保护方面 笼养繁殖 进行迁地保护及再引入的保护措施已经具有举 足轻重的作用 鸟类性别鉴定对于成功分离成 对的亲本 进行有效的繁殖至关重要 然而 全 世界的鸟类中有 60 是单态性鸟 monomorphic birds 即雌雄同型 1 即使对于一些雌雄异型 鸟类来说 只有在性成熟后 雌雄在形态上才有 区别 所以对鸟类进行性别鉴定是非常困难的 特别是对雏鸟进行安全和准确的性别鉴定就更 加困难 目前国内主要应用行为或生理等性别 鉴定方法 2 这些方法存在准确度低和易对动 物产生伤害等诸多缺点 不适用于珍稀濒危鸟 类的性别鉴定 1 因此本研究采用 DNA 分子鉴 定方

9、法进行性别鉴定 鹤形目鸟类包括雌雄同型和雌雄异型两 类 鸨科为雌雄异型 鹤科为雌雄同型 鹤形目 包括很多珍稀濒危鸟类 在本文所研究的 7 种 鹤形目鸟类中 大鸨 Otis tarda 丹顶鹤 Grus japonensis 白鹤 G leucogeranus 白头鹤 G monacha 为 国 家 一 级 保 护 鸟 类 蓑 羽 鹤 Anthropoidesvirgo 灰鹤 G rus grus 为国家二 级保护鸟类 灰冠鹤 Balearica regulorum 在我 国没有分布 为非洲特有物种 为了满足对这 些珍稀濒危鸟类的科学研究和人工繁殖要求 本研究对哈尔滨北方森林动物园 7种鹤形目鸟

10、 类的部分成体和所有亚成体的性别进行鉴定 随着分子生物学的发展 目前已经有很多 可靠 的标 记 进行 鸟 类性 别 分 子鉴 定 如 ATP5A1 基因 3 和 EE0 6 序列 4 ATP5A1 操作 较麻烦 并且 ATP5A1 在物种间变异较大 5 EE0 6 序列对 W 染色体上的特异性片段进行 扩增 雄性不被扩增 因此雌性会产生一条扩增 带 所以如果有其他因素导致 PCR 反应失败 则很可能造成性别误判 杨光等 2000 年利用 RAPD 对 3 种鹤进行过研究 但是 RAPD操作起 来比较繁琐 本研究期望找到一种方便 有效 的方法 6 目前 对于非平胸鸟类来说 应用最多的 是CHD

11、基因 鸟类的 CHD 基因位于性染色体 上 鸟类的性染色体为 ZW 型 雄性为 ZZ 雌性 为ZW CHD基因在非平胸鸟类中有两个同源 拷贝CHD W和 CHD Z 其中 CHD W 为 W 连锁 CHD Z 为Z 连锁 7 8 1995 年 Griffiths和 Tiwari 第一个发现了与 W 染色体连锁的 CHD W 基 因 全称为染色体螺旋蛋白基因 Chromobox helicase DNA binding gene 9 随后发现这个基 因非常保守 并且几乎所有非平胸雌性鸟类都 具有 CHD W 基因 10 从此这个基因开始用于 鸟类性别分子鉴定 其原理为 直接通过特异 性引物对 Z

12、 和 W 2 个染色体上同源的特异序 列进行 PCR扩增 根据在 CHD Z CHD W 基因 中内含子大小的不同 由于雌性为 ZW 型 雄性 为 ZZ 型 因此对 PCR扩增产物电泳检测时 雌 性为 2 条带 雄性为 1 条带 目前 引物 P2 P8 11 是运用 CHD 基因进行鸟类性别鉴定最普 遍的引物 引物 2550F 2718R 12 以其诸多优点 正在被推广应用 因此本研究选用这 2 个分子 标记对鹤形目7 种鸟类进行性别鉴定研究 1 材料与方法 1 1 材料 样本来自于哈尔滨北方森林动物 园笼养条件下的 7 种鹤形目鸟类 已知性别的 有大鸨 4 只 DB1 DB2 DB3 和 D

13、B4 丹顶鹤 5 只 D1 D2 D3 D4 和 D5 蓑羽鹤 2 只 S4 和 S5 灰鹤 2 只 H2 和 H3 白鹤 2 只 B3 和 B4 白头鹤 2 只 BT6 和 BT7 灰冠鹤 2只 G1 和G2 个体 为已经通过成体形态和行为进行过性别鉴定 并且通过繁殖证实的个体 待测性别的有丹顶 鹤 12 只 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16和 D17 蓑羽鹤3 只 S1 S2 和S3 灰鹤1 只 H1 白鹤4 只 B1 B2 B5 和 B6 白头 鹤 5 只 BT1 BT2 BT3 BT4 和 BT5 灰冠鹤 4 只 G3 G4 G5 和G6

14、取样方式为采取非损伤 性取样 收集脱落的羽毛 13 1 2 实验方法 1 2 1 基因组 DNA 提取 每个个体取 2 根飞 羽的羽髓 样本在消化前加入 10 l 1 mol L DTT 以破坏二硫键 用酚 氯仿法对样本基因组 DNA 进行提取 14 提取产物的含量和纯度均 在蛋白质核酸分析仪 DU 640 Beckman 公司 上进行检测 样品用 TE 调整 DNA 终浓度至 100 ng l 样品保存于 4 备用 1 2 2 PCR 扩增 反应体系为 10 l 含 200 mol L 的dNTP 1 5mmol L 的MgCl2 Primer 各 2 63 5 期田秀华等 7种鹤形目鸟类性

15、别的分子鉴定 pmol Taq DNA polymerase 0 5 U 大连宝生物公 司 模板为 100 ng 反应过程为 预变性 94 3 min 变性94 30 s 退火 49 45 s 延伸 72 30 s 共循环 30 次 完成最后一次循环后 72 延伸 7 min 所运用的两对引物为 P2 5 TCT GCATCGCTAAATCCTTT 3 和P8 5 CTCCCAA GGATGAGRAAYTG 3 11 2550F 5 GTT ACTGA TTCGTCTA CGAGA 3 和 2718R 5 ATTGAAAT GATCCAGTGCTTG 3 12 1 2 3 电泳及结果记录 取

16、10 l PCR 扩增产 物 在 3 的琼脂糖凝胶上电泳 30 min 用凝胶 成像仪 Vilber Lourmat 公司 进行拍照记录结 果 电泳结果中 单条带表示此个体性别为雄 性 双带表示此个体性别为雌性 2 结 果 2 1 2 对引物的有效性 利用 19 只已知性别 的个体对 2 对引物的有效性进行了验证 用引 物 P2 P8 进行扩增 琼脂糖凝胶电泳检测雌雄 均只显示出 1 个条带 因此 不能方便 有效的 对 7 种鹤形目鸟类进行性别鉴定 而引物 2550F 2718R的扩增产物清晰显示 雌性为 2 个 条带 雄性为 1 个条带 因此 能方便有效的对 这 7 种鸟类进行性别鉴定 图1

17、 为 2 对引物电 泳对比结果的部分图片 图 1 2 对引物 P8 P2 和 2550F 2718R性别鉴定结果对比图 Fig 1 Results of the sex identification using 2 primers P8 P2 and 2550F 2718R M 引物 Maker D2 D5 个体编号 No of bird 图 2 引物 2550F 2718R对 7 种鹤形目鸟类性别鉴定结果图 Fig 2 Results of sex identification for 7 different species of Gruiformes 2 2 7 种鹤形目鸟类性别鉴定结果

18、利用筛 选出的有效引物 2550F 2718R 对鹤形目 7 种鸟 类中已知性别的 19 只个体进行鉴定 确定 PCR 反应条件以及模板的用量 19 只已知性别个 体的性别鉴定结果见表 1 结果与已知性别相 符 准确率为 100 对鹤形目 7 种鸟类 29 只未知性别鸟类的 性别进行了鉴定 结果见表 2 图 2 表示利用 引物 2550F 2718R对 7 种不同种鸟类雌雄个体 进行性别鉴定的部分电泳检测结果图 3 讨 论 3 1 2 对引物的有效性分析 引物 P2 P8 和 2550F 2718R尽管扩增的不是同一个内含子 但 64 动物学杂志 Chinese Journal of Zool

19、ogy41卷 表 1 7 种鹤形目鸟类中已知性别个体鉴定结果 Table 1 Results of sex identification for known sexingbirds in 7 species of Gruiformes 编号 No of bird 已知 性别 Known sex 鉴定 性别 Identified sex 编号 No of bird 已知 性别 Known sex 鉴定 性别 Identified sex DB1 S5 DB2 H2 DB3 H3 DB4 B3 D1 B4 D2 BT6 D3 BT7 D4 G1 D5 G2 S4 表 2 7 种鹤形目鸟类中未知性别

20、个体鉴定结果 Table 2 Results of sex identification for sex unknown birds in 7 species of Gruiformes 编号 No of bird 鉴定性别 Identified sex 编号 No of bird 鉴定性别 Identified sex 编号 No of bird 鉴定性别 Identified sex D6 D16 BT1 D7 D17 BT2 D8 S1 BT3 D9 S2 BT4 D10 S3 BT5 D11 H1 G3 D12 B1 G4 D13 B2 G5 D14 B5 G6 D15 B6 性别鉴定

21、原理相同 但是在一些物种中 P2 P8 扩增 CHD Z 基因和 CHD W 基因的 PCR 产物大 小十分相似 琼脂糖凝胶电泳很难区分 CHD Z 基因和CHD W 基因 本研究中的 7 种鹤形目鸟 类就面临着此类情况 面对这种情况一般改用 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 也有的采用限制性 内切酶对 P2 P8 的 PCR 扩增产物进行酶切 然 后再进行琼脂糖凝胶电泳 15 另外 研究显示 CHD Z 基因进化速度较快 16 17 所以引物P2 P8 所扩增 CHD Z 基因的内含子在一些物种中自 身出现多态性 导致 P2 P8 对 CHD Z 基因的 PCR扩增产物出现 2 个或多个等位基因 18

22、 这样有时雄性的电泳结果会出现两条带 必须 进行认真分型 才能进行性别鉴定 但是特殊 情况下 CHD W 基因和某个 CHD Z 等位基因只 差 1 2 bp 时 分型判读非常困难 只有通过毛 细管电泳才能解决此类难题 而变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳和毛细管电泳比琼脂糖凝胶电泳操 作繁琐 不能达到操作简单 快捷的目的 因此 放弃了这对引物 没有对其进行进一步研究 引物 2550F 2718R 扩增 7 种鹤形目鸟类雌 雄个体的产物明显不同 易于区别 见图 1 2 另外 现有的研究表明 引物 2550F 2718R所扩 增的目标片段还不存在 CHD Z 基因和 CHD W 基因的 PCR产物大小十分

23、相似 CHD Z 基因的 PCR 扩增 产 物 自 身 多 态 性 现象 18 引 物 2550F 2718R与引物 P2 P8 相比 还存在一个优 点 就是被扩增出的 CHD W 基因片段小于 CHD Z 基因片段 由于在 PCR反应中小片段占 有优势 特别在 PCR 反应很弱的情况下 只要 电泳结果中出现CHD W 基因的扩增产物 就会 很准确的进行性别鉴定 然而 引物 P2 P8通常 扩增出的 CHD W 基因产物大于 CHD Z 基因产 物 在 PCR 反应很弱的情况下 则很容易产生 误判 19 因此 笔者采用引物 2550F 2718R 来 建立 7种鹤形目鸟类性别的分子鉴定方法 3

24、 2 7 种鹤形目鸟类性别鉴定结果分析 只 有准确的性别鉴定才能保证人工繁殖和人工育 种的正确进行 此研究成功地对哈尔滨北方森 林动物园7 种鹤形目鸟类未知性别的成体和所 有亚成体进行了性别鉴定 有利于今后的人工 繁殖工作 特别是亚成体的性别鉴定有利于其 尽早配对 进行繁殖 同时也发现某些种类的 雌雄比例失调 如 白头鹤 5 只亚成体 BT1 BT2 BT3 BT4和 BT5 都为雌性 这种情况很可 能影响未来哈尔滨北方森林动物园白头鹤的繁 殖 鉴于这种结果 已经向哈尔滨北方森林动 物园提出了建议 对当年将繁殖出的白头鹤个 体进行性别鉴定 也可以用当年的雄鹤与这些 亚成体配对 可以与其他动物园

25、和保护区进行 65 5 期田秀华等 7种鹤形目鸟类性别的分子鉴定 个体交换 此项研究对动物园中鹤类的繁殖起 到了指导作用 2003 年白鹤饲养人员通过几 年的观察发现 B5 和 B6 2 只白鹤的行为完全不 同 因此被确定为一对繁殖亲本 进行单笼饲养 进行繁殖 但一直未能成功 通过表 1 可以看 出 B5 和 B6 为一对雌鹤 因此根据本实验的结 果已经将其分离 重新择偶配对进行繁殖 在本研究性别鉴定的 7 种鹤形目鸟类中 大鸨不但与其他鸟类不是同科 而且属于雌雄 异型 大鸨成体的外型雌雄存在着很大差别 但雏鸟的性别用常规方法很难区分 这给各动 物园和保护区之间的大鸨雏鸟引进和交换带来 了极大

26、困难 本研究为了解决这方面的问题 对大鸨的性别进行了鉴定 为今后大鸨雏鸟的 性别鉴定提供了有效的途径和可靠的方法 从 图2 上可以看出 大鸨的带型与其他 6 种鸟类 有着明显的区别 对于其他 6 种鸟类来说 引 物2550F 2718R 在W 染色体上的扩增片段小于 Z 染色体上的扩增片段 但是对于大鸨来说正 好相反 引物 2550F 2718R 在 W 染色体上的扩 增片段大于Z 染色体上的扩增片段 目前国内 外已经利用引物 2550F 2718R 对很多鸟类进行 了性别鉴定 引物 2550F 2718R 在 W 染色体上 的扩增片段大于 Z 染色体上的扩增片段这种现 象 本研究为首次报道

27、为此 对引物 2550F 2718R扩增大鸨的 W 染色体和 Z 染色体上产 物进行了测序分析 发现 2550F 2718R 扩增大 鸨的 W 染色体产物长度为 1 034 bp Z 染色体 产物长度为 656 bp 2 个产物在序列上具有同 源性 表明 W 染色体产物并非其他非特异性扩 增 由于现有的研究显示 CHD W 基因非常保 守 不容易出现变异 17 20 21 然而 大鸨与其他 鸟类相比出现了极大的变异 这种结果产生的 具体原因还不清楚 待于进一步研究 综上所述 本研究所运用的性别分子鉴定 方法非常适用于所研究的 7 种鹤形目鸟类 且 显示出安全 方便 准确等诸多优点 实验所用 的

28、引物 2550F 2718R 在位于稳定外显子 22 为 通用引物 可以推广到其他物种 本实验采取 非损伤性取样 不但满足笼养珍稀濒危鸟类的 研究要求 还可以推广到野外的珍稀濒危鸟类 目前 本研究方法只针对部分非平胸鸟类进行 有待于今后逐步完善和进一步推广使用 参 考 文 献 1 Berm dez Humar n L G Garciagarcia A Leal Garza C H et al Molecular sexing of monomorphic endangered Ara birds Journal of Experimental Zoology 2002 292 677 680

29、2 李刚 杨水云 周航等 鸟类性别鉴定技术研究进展 动 物学杂志 2003 38 5 106 108 3 Itoh Y Ogawa A Identification of the sex of a wide range of carinatae birds by PCR using primersets selected from chicken EE0 6 and its related sequences The American Genetic Association 2001 9 2 315 2 321 4 Orgawa A Solovei I Hutchison N Molecula

30、r characterization and cytological mapping of a non repetitive DNA sequence region from the W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing Carinatae bird Chromosomeres 1997 5 93 101 5 Eason D Millar G D Cree A et al A comparison of five methods for assignment of sex in the takah

31、e Aves Porphyrio mantelli The Zoological Society of London 2001 253 281 292 6 杨光 陈红卫 杨玉等 几种鹤性别的分子生物学鉴定 四川大学学报 自然科学版 2000 37 6 911 915 7 Lessells K Mateman C Molecular sexing of birds Nature 1996 383 761 762 8 Griffiths R Korn R A CHD1 gene is Z chromosome linked in the chicken Gallus domesticus Gene

32、 1997 197 225 229 9 Griffiths R Tiwari B Sex of the last wild Spix s macaw Nature 1995 375 454 10 Griffiths R DaanS Dijkstra C Sex identification inbirds using two CHD genes Proceedings of the Royal Society of London Series B 1996 263 1 251 1 256 11 Griffiths R Double M C Orr K et al A DNA test to s

33、ex most birds Molecular Ecology 1998 7 1 071 1 075 12 Fridolfsson A K Ellegren H A simple and universal method for molecular sexing of non ratite birds Journal of A vian Biology 1999 30 116 121 13 Taberlet P Waits L P Luikart G Noninvasive sampling look before you leap Trends in Ecology and Evolutio

34、n 1999 14 323 327 14 田秀华 刘铸 白素英 珍稀濒危鸟类微量取样及 DNA 提取的研究 经济动物学报 2005 9 4 215 218 15 Sacchi P Soglia D Maione S et al A non invasive test for sex identification in Short toed Eagle Molecular and Cellular 66 动物学杂志 Chinese Journal of Zoology41卷 Probes 2004 18 193 196 16 Fridolfsson A Ellegren H Molecular

35、evolution of the avian CHD1 genes on the Z and W sex chromosomes Genetics 2000 155 1 903 1 912 17 Montell H Fridolfsson A Ellegren H Contrasting levels of nucleotide diversity on the avian Z and W sex chromosomes Molecular Biology and Evolution 2001 18 11 2 010 2 016 18 Dawson D A Darby S Hunter F M

36、 et al A critique of avian CHD based molecular sexing protocols illustrated by a Z chromosome polymorphismdetected in auklets Molecular Ecology Notes 2001 1 201 204 19 Arnold K E Orr K J Griffiths R Primary sex ratios in birds problems with molecular sex identification of undeveloped eggs Molecular

37、Ecology 2003 12 3 451 3 458 20 Sundstr m H Webster M T Ellegren H Is the rate of insertion and deletion mutation male biased molecular evolutionary analysis of avian and primate sex chromosome sequences The Genetics Society of America 2003 164 259 268 21 Mc Culloch D Gems D Evolution of male longevity bias in nematodes Aging Cell 2003 2 165 173 22 Inoue Murayama M Ueda Y Yamashita T et al Molecular sexing of Japanese cormorants used for traditional fishing on the Nagara River in Gifu City Animal Science Journal 2002 73 417 420 67 5 期田秀华等 7种鹤形目鸟类性别的分子鉴定

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