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吴昊星、刘晓刚合作团队Angew：近红外四嗪生物正交探针的通用设计策略和机理解释

花匠小妙招
2024-09-19 08:21

吴昊星、刘晓刚合作团队Angew：近红外四嗪生物正交探针的通用设计策略和机理解释

2022-03-10

四嗪生物正交化学因其快速的反应动力学和优异的荧光调控性，是最有发展前景的生物正交化学工具之一。近年来，四嗪生物正交化学已经被广泛应用于蛋白质功能调控、超高分辨荧光成像、疾病诊断、药物开发等生物医学领域，基于四嗪生物正交化学设计的抗肿瘤药物已于2020年进入临床I期研究。设计荧光开启型生物正交探针，可降低生物正交标记中探针自身荧光信号的干扰，避免细胞成像时反复洗涤，提高细胞和活体生物成像信噪比。这些探针已经用于监测细胞亚细胞结构的时空动态变化和活体疾病诊疗研究。目前，通过荧光能量转移（FRET）、分子内电荷转移（ICT）等策略，实现了四嗪对可见光区域荧光染料的有效调控。

与可见光相比，近红外荧光拥有更深的组织穿透深性、更低的光毒性并受生物分子自发荧光干扰更小，更适合于活体深层组织成像。然而，发射波长大于700 nm且荧光增强超过100倍的四嗪荧光探针仍鲜有报道。虽然本文的吴昊星课题组曾于2021年报道了荧光探针原位生成策略，构建了新颖的Huaxi-Fluors探针体系，实现了从可见光到近红外波长数百倍的荧光开启（Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 2393）。但是对广泛商品化的经典近红外荧光分子（如硅罗丹明、花菁染料）的高效调控策略仍无报道，从而制约了相关的活体成像应用。

近日，四川大学吴昊星（点击查看介绍）课题组和新加坡科技与设计大学刘晓刚（点击查看介绍）课题组报道了针对经典近红外荧光分子的开启型四嗪生物正交探针的通用设计策略，并通过计算化学验证了设计的合理性，揭示了荧光调控机制。该系列探针与亲二烯体反应后，在586–806 nm波长范围内荧光开启倍数可达102–103倍，同时保留了荧光母核的其它荧光性能。

Figure 1. Schematic illustrations of the wavelength-dependent fluorogenicity and fluorescence turn-on ratios of tetrazine-based probes (a, b)。(c) Schematic illustration of the PeT mechanism via the SLEET model. (d) Optimized molecular structures of 7 in the ground and excited states, as well as the corresponding electron and hole distributions in water.

他们利用叔胺将四嗪与罗丹明衍生物和花菁染料等经典染料的meso-位直接相连，缩短了四嗪与荧光母核的距离，在空间上利于两者发生强烈的电子相互作用，促进PeT的发生；相较于仲氨基而言，叔氨可以防止荧光发射蓝移，从而提高荧光开启比。由于PeT过程不受荧光团和淬灭接团之间光谱重叠程度的限制，因此这种设计策略还可以打破传统能量转移策略的调控波长限制（Fig. 1）。

基于以上策略，作者合成并表征了meso-位氨基四嗪修饰的氧-罗丹明、碳-罗丹明、硅-罗丹明以及花菁染料Cy7荧光探针。该系列四嗪探针与BCN、TCO、Sph等亲二烯体反应后，在荧光开启倍数可达100–1459倍，发射波长覆盖586–806 nm。其中，花菁类四嗪生物正交探针7（λem = 806 nm）荧光增强可达100倍，比已报道四嗪菁染料的荧光增强高出近20倍。随后，作者利用密度泛函理论 (DFT) 和时间依赖的密度泛函理论 (TD-DFT) 计算进一步阐明荧光猝灭机制：对于发射波长＞700 nm的探针，其激发态S1能级低于四嗪的S1能级，故能量不会转移到四嗪暗态，从而非传统的能量转移机制。但由于四嗪和荧光团具有更近的空间距离，电子转移所需能量更低，可通过PeT效应实现荧光淬灭。当四嗪与亲二烯体反应后，四嗪被破坏而导致PeT效应消失，荧光得以恢复。而对于发射波长＜700 nm的染料，其激发态S1能级高于四嗪的S1能级，因此四嗪可在ETDS和PeT双重机制的共同作用下实现对荧光分子的高效调控。

Figure 2. (a) Synthesis of tetrazine probes. (b) Fluorogenic reactions between tetrazine probes and dienophiles. (c) Emission spectra of probe 5 (blue) and the corresponding bioorthogonal product (red). (d) Photophysical properties of probe bioorthogonal product. (e) Wash-free imaging using 2 and 3 for mitochondria in vitro and tumor in vivo.

这类探针还具有较好的化学稳定性，且光稳定性优于部分商品化荧光探针，成功实现了活细胞亚细胞结构线粒体的免洗生物成像、活鼠卵巢癌移植瘤成像，均具有优异的分辨率和信噪比（Fig. 2e）。该工作通过新型设计策略，将四嗪调控荧光染料的波长范围成功拓宽到了800 nm区域，有利于进一步拓展四嗪生物正交化学在分子影像、活体生物医学等领域的应用。

相关研究结果发表于近期的Angewandte Chemie International Edition，第一作者为四川大学助理研究员毛梧宇博士和新加坡科技设计大学迟伟杰博士。相关工作受到国家自然科学基金、中国博士后科学基金、新加坡科学技术研究理事会先进制造工程基金等项目的资助。

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