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一种硬叶兰组织培养繁育方法.pdf

花匠小妙招
2025-05-01 18:40

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510781057.4 (22)申请日 2015.11.13 (65)同一申请的已公布的文献号申请公布号 CN 105284623 A (43)申请公布日 2016.02.03 (73)专利权人广西壮族自治区药用植物园地址 530023 广西壮族自治区南宁市兴宁区长堽路189号 (72)发明人王晓峰李刚缪剑华韦坤华李翠李林轩王一诺 (74)专利代理机构广西南宁公平知识产权代理有限公司 45104 代理人黄永校 (51)Int.Cl. A01H 4/0。

2、0(2006.01) 审查员陈仕高 (54)发明名称一种硬叶兰组织培养繁育方法 (57)摘要一种硬叶兰组织培养繁育方法，包括如下步骤： (1)取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体进行消毒； (2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导得到无菌试管苗； (3)将所述无菌试管苗置于MS繁殖培养基中进行试管苗快速繁殖培养获得丛生芽。采用本发明所述的培养方法得到的硬叶兰丛生芽增殖系数达到20-30倍，能够在短时间内提供健壮的硬叶兰优质种苗，有效解决硬叶兰规模化育苗的问题。权利要求书1页说明书3页 CN 105284623 B 2017.10.20 CN 105284。

3、623 B 1.一种硬叶兰Cymbidium bicolor Lindl.组织培养繁育方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：（1）外植体的选择与消毒：取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2 % v/v洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温- 20的100毫升0.1 % v/v升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；（2）初代诱导获得无菌试管苗：将步骤（1）得到的外植体剥取0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接。

4、种到MS诱导培养基中，在培养温度为23-27，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS诱导培养基中添加0.3mg/L的6-BA、 4.0mg/L的NAA、 2.0mg/L的PVP、 30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；（3）丛生芽快速繁殖培养：将步骤（2）中得到的无菌试管苗置于1/3MS繁殖培养基中，在培养温度为23-27，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到丛生芽，其中1/3MS繁殖培养基中添加2.0-5.0mg/L的6-BA、 0.2-0.6mg/L。

5、NAA、 2.0mg/L的PVP、 30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。权利要求书 1/1 页 2 CN 105284623 B 2 一种硬叶兰组织培养繁育方法技术领域 0001 本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种硬叶兰组织培养繁育方法。背景技术 0002 硬叶兰(Cymbidium bicolor Lindl.)为兰科药用植物，全草入药，具有散瘀止血、清热润肺、化痰止咳等功效。此外，硬叶兰还极具观赏价值。但硬叶兰的种子非常细小，仅有发育不完全的胚，本身无法储存养分，自然条件下，其种子萌发阶段完全依靠菌根真菌为其提供养分，自。

6、然繁殖率低，时间长。因此，野生硬叶兰非常稀少，由于长期过度采掘及生态环境的破坏，硬叶兰已处于濒危状态，种子种苗稀缺，资源更新非常困难。发明内容 0003 本发明的目的是提供一种硬叶兰组织培养繁育方法，能够快速有效地提高硬叶兰种苗的繁殖速度和质量，实现硬叶兰优质种苗的工厂化育苗，以满足生产上的需要。 0004 本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种硬叶兰组织培养繁育方法，包括以下步骤： 0005 (1)外植体的选择与消毒：取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2v/v洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添。

7、加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1v/v升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水； 0006 (2)初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS诱导培养基中，在培养温度为23-27，光照强度1500lux，光照时间为8- 10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS诱导培养基中添加0.3mg/L的6-BA、 4.0mg/L的NAA、 2.0mg/L的PVP、 30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8； 000。

8、7 (3)丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于1/3MS繁殖培养基中，在培养温度为23-27，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到丛生芽，其中1/3MS繁殖培养基中添加2.0-5.0mg/L的6-BA、 0.2-0.6mg/LNAA、 2.0mg/L 的PVP、 30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。 0008 本发明的突出优点在于： 0009 (1)采用生物技术对硬叶兰进行组织培养快速繁殖，能够在短时间内培育出大量适合栽培种植的硬叶兰幼苗，保障硬叶兰种苗的增殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满。

9、足生产上的需要。 0010 (2)采用本发明所述的培养方法得到的硬叶兰丛生芽增殖系数达到20-30倍，丛生芽健壮，接种到生根培养基后容易生根。具体实施方式 0011 下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。说明书 1/3 页 3 CN 105284623 B 3 0012 实施例1 0013 本发明所述的硬叶兰组织培养繁育方法的一个实例，包括以下步骤： 0014 (1)外植体的选择与消毒：取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2v/v洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1v/。

10、v升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水； 0015 (2)初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2- 0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS诱导培养基中，在培养温度为23-27，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS诱导培养基中添加 0.3mg/L的6-BA、 4.0mg/L的NAA、 2.0mg/L的PVP、 30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为 5.8； 0016 (3)丛生芽快速繁殖培养。

11、：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于1/3MS繁殖培养基中，在培养温度23-27，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到丛生芽。其中， 1/3MS繁殖培养基中添加2.0mg/L的6-BA、 0.3mg/L的NAA、 2.0mg/L的PVP、 30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽增殖系数为21.6。 0017 实施例2 0018 本发明所述的硬叶兰组织培养繁育方法的又一个实例，包括以下步骤： 0019 (1)外植体的选择与消毒：取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2v/v洗洁精水溶液。

12、浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1v/v升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水； 0020 (2)初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2- 0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS诱导培养基中，在培养温度为23-27，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到无菌试管苗，其中MS诱导培养基中添加 0.3mg/L的6-BA、 4.0mg/L的NAA、 2.0mg/L的PVP、。

13、 30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为 5.8； 0021 (3)丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于1/3MS繁殖培养基中，在培养温度23-27，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到丛生芽，其中1/3MS繁殖培养基中添加3.0mg/L的6-BA、 0.4mg/L的NAA、 2.0mg/L的PVP、 30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽增殖系数为24.8。 0022 实施例3 0023 本发明所述的硬叶兰组织培养繁育方法的再一个实例，包括以下步骤： 0024 (1)外植体的选择与消。

14、毒：取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2v/v洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1v/v升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水； 0025 (2)初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2- 0.3mm的茎尖分生组织，接种到MS诱导培养基中，在培养温度23-27，光照强度1500lux，光照时间8-10小时/天的条件下，培养60天，得到无菌试管苗。其中。

15、， MS诱导培养基中添加说明书 2/3 页 4 CN 105284623 B 4 0.3mg/L的6-BA、 4.0mg/L的NAA、 2.0mg/L的PVP、 30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为 5.8； 0026 (3)丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于1/3MS繁殖培养基中，在培养温度23-27，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到丛生芽，其中1/3MS繁殖培养基中添加3.0mg/L的6-BA、 0.5mg/L的NAA、 2.0mg/L的PVP、 30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为。

16、5.8，丛生芽增殖系数为30.2。 0027 实施例4 0028 本发明所述的硬叶兰组织培养繁育方法的又一个实例，包括以下步骤： 0029 (1)外植体的选择与消毒：取硬叶兰健康植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去外层包叶后，依次用2v/v洗洁精水溶液浸泡5min，线状自来水冲洗15-30min，添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1v/v升汞消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次，最后，用消毒滤纸除去表面水分，得到无菌外植体。其中，无菌水为经高压灭菌的蒸馏水； 0030 (2)初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于解剖镜下，剥去0.2- 0.。

17、3mm的茎尖分生组织，接种到MS诱导培养基中，在培养温度23-27，光照强度1500lux，光照时间8-10小时/天的条件下，培养60天，得到无菌试管苗。其中， MS诱导培养基中添加 0.3mg/L的6-BA、 4.0mg/L的NAA、 2.0mg/L的PVP、 30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为 5.8； 0031 (3)丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于1/3MS繁殖培养基中，在培养温度23-27，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养60天得到丛生芽。其中， 1/3MS繁殖培养基中添加了5.0mg/L的6-BA、 0.6mg/L的NAA、 2.0mg/L的PVP、 30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽增殖系数为23.5。说明书 3/3 页 5 CN 105284623 B 5 。