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姜花属植物根尖细胞染色体中期分裂相装片的方法及其应用与流程

花匠小妙招
2025-05-02 12:04

技术领域：

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种姜花属植物根尖细胞染色体中期分裂相装片的方法及其应用。

背景技术：
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姜花属(hedychiumkoen)是姜科多年生草本植物，全世界有约50个种，中国28个种，其中特有种18个。姜花属植物有许多种重要的传统药用植物，如《中华大词典》记载的草果和姜花，主治胃寒痛、消化不良等，《四川中药志》记载的土羌活，主治风湿筋骨疼痛及跌打损伤等，还有毛姜花可祛风止咳，黄白姜花有解表散寒、利湿消肿、温胃止呕及消食健胃等功效。现代研究发现姜花属植物含有挥发油，可以用来提取香精。姜花属植物株型优美，花朵色彩艳丽，果序纷繁多样，极具园艺观赏价值。然而，姜花属植物遗传背景较模糊，形态变异复杂，导致其分类困难，物种数目不确定，物种进化关系不明朗。这影响了姜花属植物药用价值的开发利用和优良花卉品种的选育。高效制备姜花属植物的中期染色体，染色体数目、染色体核型分析，如4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,dapi)和碘化丙啶(propidiumiodide,pi)联合染色(cpd:combinedpianddapi)、荧光原位杂交(fish:fluorescenceinsituhybridization)定位分析等等细胞遗传信息，有助于姜花属植物的物种分类与进化的研究。

但是目前，姜花属植物染色体与核型分析的研究很少，所用的制备姜花属植物染色体的方法基本为压片法。姜花属植物资源多来源于野生环境，其根尖表面细胞有明显的木质化，细胞不易分离，使用常规压片法时，解离液效果往往不佳，要么是染色体易重叠,很难得到清晰的分裂相,要么是染色体结构变形，难以达到cpd染色和荧光原位杂交实验所需染色体的标准。压片法获得的染色体装片如要进行深入的分子细胞遗传学分析，还需利用液氮迅速冷后揭片，这一过程中容易出现装片断裂或盖玻片揭除不彻底的现象，无法进行后续实验。而利用常规酶解法和火焰干燥法制备姜花属植物中期染色体的过程中发现，染色体装片中杂质特别多，染色体分散性不好，重叠明显，荧光原位杂交实验中信号检出率极低。分析原因①姜花属植物根尖表面细胞木质化程度高，酶解法很难彻底分解。②火焰干燥法的敲片过程中，要求把材料敲碎，对木质化程度高的根尖生长点来说，该过程需要花费较长时间，且为了保持湿润需要多次加固定液，容易造成染色体的流失，使分裂相减少。③留在玻片上的非分裂相细胞相对增加，加上表皮细胞的残渣，使得杂交过程中探针很难与染色体结合，信号检出率自然低，杂交效果不佳。

技术实现要素：
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本发明的目的在于提供一种姜花属植物根尖细胞染色体中期分裂相装片的方法及其应用，本发明制备的圆瓣姜花、姜花、红姜花等姜花属植物的中期染色体装片，每片的分裂相在20个以上，再应用于cpd染色和fish杂交实验，cpd染色显示染色带纹较清晰，染色体之间有差异性，同一染色体不同部位带纹也不完全一致，45srdnafish杂交信号清晰，检出率高达90％以上。

为解决上述问题，本发明的技术方案是：

一种姜花属植物根尖细胞染色体中期分裂相装片的方法，包括如下步骤：

步骤一、根尖的培养、采集和固定：种植姜花属植物植株至根长到1－1.5cm取根尖，将根尖置于预处理液中进行预处理，再用水漂洗后加入固定液固定得到固定好的根尖；

步骤二、根尖处理制片：

a)取固定好的根尖0.2-0.3cm左右，双蒸水清洗，再用柠檬酸缓冲液冲洗的导清洗后的根尖；

b)酶解：清洗后的根尖用质量分数4％的纤维素酶、0.6％的果胶酶和3％的离析酶的混合液28℃下酶解4h然后转入4℃冰箱酶解过夜；

c)后低渗：吸出混合液，用双蒸水冲洗根尖，再用双蒸水浸泡根尖；

d)再固定：吸出水，然后加入固定液再固定根尖；

e)制片：取一个根尖于干净的载玻片上，滴一滴固定液，用工具将根尖挤压至糊状，然后滴2-3滴固定液，涂开，使根尖分散；酒精灯上烤至着火，待火自然熄灭，冷却即可得到染色体装片。进一步的改进，步骤e)中，若有未成糊状的根尖部分，则夹出，弃之不用。

进一步的改进，还包括步骤三、保存将染色体装片经空气干燥后，置于-20℃贮存备用。

进一步的改进，所述步骤一包括如下步骤：

一)将姜花属植物植株移至装有腐殖土与椰糠质量比8:2的套盆中，于室外树下培养；套盆的内盆有排水孔，外盆正常；

二)在移栽后2周后初次取根，以后每次取根间隔1周，取根时将外盆取出，即可取下从内盆排水孔伸出来的根尖，其中取根长到1－1.5cm时的根尖；

三)将取下的根尖先置于装有双蒸水的样品瓶里漂洗5分钟，将双蒸水吸出加入预处理液，饱和的α-溴代萘溶液；盖上瓶盖，贴上标签，室温下处理45分钟。再吸出预处理液，用双蒸水漂洗2次5分钟，然后再吸出双蒸水加入固定液，放置于4℃冰箱内过夜；所述固定液包括3体积份的甲醇和1体积份的冰醋酸。

进一步的改进，所述步骤二包括如下步骤：

a.根尖的切取和清洗：用刀片取固定好的根尖0.2-0.3cm处的根尖生长点左右，双蒸水洗4次，每次5min，再用ph4.5的柠檬酸缓冲液洗3次，每次5分钟；

b.酶解：用质量分数4％的纤维素酶、0.6％的果胶酶和3％的离析酶的混合液在28℃下酶解4h，然后转入4℃冰箱酶解过夜；

c.后低渗：吸出酶液，用双蒸水冲洗根尖1-2次，再用双蒸水浸泡2min；

d.再固定：吸出水，加入固定液再固定材料；

e.制片：吸出1个根尖生长点于干净的载玻片上，滴一滴固定液，用镊子先轻轻挤压材料至糊状，滴2-3滴固定液，迅速涂开，使材料分散，火烤至着火，得到染色体装片。

一种上述的姜花属植物根尖细胞染色体中期分裂相装片的方法制得的染色体装片的用途，其特征在于，所述染色体装片用于复合染料染色显带或荧光原位杂交实验。

进一步的改进，所述复合染料染色显带包括cpd染色；所述荧光原位杂交实验包括fish杂交实验和45srdnafish杂交实验。

本发明的优点：

1.采用林下套盆移栽培养。姜花属植物多喜阴，本方法于室外树下培养，有助于植物的生长。腐殖土有利于姜花属植物根系生长，加少量椰糠可以使土质疏松透气透水效果好，根系生长快；带排水孔的内盆可以保证根系有充分生长的空间，套上外盆培养，这样取根的时候只要将外盆取下，就可以取到新生的根尖，无需将植物从土壤种分出，便于多次取根，而且对植物根系的伤害降到最低，确保植株正常生长，成活率达100％。

2.改良的制片方法。姜花属植物根系明显木质化表皮细胞是非常难破坏和彻底酶解掉的，利用常规的敲片法一味的将材料一起敲碎制片，反倒将跟多的杂质留在玻片上，影响制片质量。本法在酶解后再敲片前将木质化表皮细胞小心丢弃不用，不仅缩短了制片时间和难度，减少了杂质，相对提高了染色体分裂相的数目，大大增加了后续实验的成功率，以45srdnafish杂交为例，信号检出率95％以上。

附图说明

图1为用本方法制备的姜花属植物圆瓣姜花中期染色体cpd染色图一；

图2为用本方法制备的姜花属植物圆瓣姜花中期染色体cpd染色图二；

图3为用本方法制备的姜花属植物姜花中期染色体cpd染色图一；(箭头所示为cpd带)；

图4为用本方法制备的姜花属植物姜花中期染色体cpd染色图二；(箭头所示为cpd带)；

图5为用本方法制备的姜花属植物姜花中期染色体45srdnafish图一；(箭头所示为45srdna信号位点)；

图6为用本方法制备的姜花属植物姜花中期染色体45srdnafish图二；(箭头所示为45srdna信号位点)。

具体实施方式：

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

(一)根尖的培养、采集和固定

(1)将姜花属植物植株移至装有腐殖土与椰糠(8:2)的套盆(内盆有排水孔，外盆正常)中，于室外树下培养。

(2)初次取根可在移栽后2周后，以后每次取根间隔1周，待根长到1－1.5cm时取根尖。将外盆取出，即可取下从内盆排水孔伸出来的根尖。

(3)将根尖先置于装有双蒸水的样品瓶(如干净的青霉素瓶子)里漂洗5分钟，将双蒸水吸出加入预处理液――α-溴代萘。盖上瓶盖，贴上标签，室温下处理45分钟。再吸出预处理液，用双蒸水漂洗2次5分钟，然后再吸出双蒸水加入固定液(3份甲醇：1份的冰醋酸)，放置于4℃冰箱内过夜。

(二)根尖处理制片

(1)根尖的切取和清洗：用刀片取固定好的根尖0.2-0.3cm左右(根尖生长点)，双蒸水洗4次，每次5min，再用柠檬酸缓冲液(ph＝4.5)洗3次，每次5分钟。

(2)酶解：用4％的纤维素酶、0.6％的果胶酶(pectolyasey23)和3％的离析酶(macerozymer-10)的混合液在28℃下酶解4h，然后转入4℃冰箱酶解过夜；

(3)后低渗：吸出酶液，用双蒸水冲洗根尖1-2次，再用双蒸水浸泡2min；

(4)再固定：吸出水，加入新配制的固定液再固定材料。

(5)制片：吸出1个根尖生长点于干净的载玻片上，滴一滴固定液，用镊子先轻轻挤压材料至糊状，滴2-3滴固定液，迅速涂开，使材料分散，火烤至着火。若有未成糊状的材料(根尖生长点木质化表皮细胞)，用镊子夹出，弃之不用。制片时要尽量压碎材料，在敲打时要适时添加固定液，每次半滴，既要保证玻片湿润，又要防止材料不流失。

三、装片的保存与应用

染色体装片经空气干燥后，置于-20℃贮存备用，用时再需先干燥，可以进行复合染料染色显带实验如cpd染色，也可进行荧光原位杂交实验进行特定dna序列的染色体定位实验，为进一步探索和解读姜花属物种的遗传背景提供有利支撑。

利用本方法制备的圆瓣姜花、姜花、红姜花等姜花属植物的中期染色体装片，每片的分裂相在20个以上，再应用于cpd染色和fish杂交实验，cpd染色显示染色带纹较清晰，染色体之间有差异性，同一染色体不同部位带纹也不完全一致(图1、图2)，45srdnafish杂交信号清晰，检出率高达90％以上(图3)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。