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金钗石斛居群遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建

花匠小妙招
2025-05-10 04:51

石斛Dendrobium nobile Lindl.俗称金钗石斛，为多年生附生型兰科（Orchidaceae）草本植物[1]，是石斛属中最重要且最具代表性的植物之一。石斛属植物对生长环境要求较高，多分布于热带、亚热带地区，在我国主要分布在广西、云南、贵州、四川等省份[2]，其中，以贵州赤水的金钗石斛最为出名。金钗石斛花色丰富艳丽，花姿优美，极具观赏价值。除此之外，金钗石斛还是一种重要的药用石斛，历届版本的《中国药典》均将其收录在册，《神农本草经》更是将金钗石斛列为上品，药用价值可见一斑。金钗石斛全株皆可入药，其植株中含有多糖、联苄苯、石斛碱和黄酮类等多种物质[3]，具有降血糖、调血脂、消炎、抗衰老、抗肿瘤等功效[4]。但由于金钗石斛经济价值较高，人为挖采活动日益猖獗，野生金钗石斛资源急剧下降，种质资源的保育工作尤为重要。

石斛属内种间遗传多样性丰富，近年来石斛杂交新种的不断增多更加剧了石斛属植物从外观上难以区分的问题，甚至小部分石斛存在异物同名、同物异名的情况[5]，石斛属植物的鉴定工作受到一定限制。随着分子生物学的发展，分子标记技术为石斛种质资源的鉴定提供了有效手段。引物结合位点间扩增（inter-primer binding site，iPBS）分子标记是一类基于LTR序列反转录转座子开发的新型分子标记技术[6]，它是以PCR技术为基础，以反转录转座子为保守位点设计引物，对基因组DNA进行扩增的分子标记。具有操作简单、高效，技术成本低，多态性丰富等优点[7]，比常规的分子标记更具优势[8]，相对于其他基于逆转录转座子开发的标记有效性更高[9]，可广泛应用于动植物种质鉴定工作中。先前研究表明，iPBS标记的扩增多态性高于简单重复序列间扩增（inter-simple sequencerepeat，ISSR）[10]，同时使用成本低于简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）标记，比扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）标记更易于操作[11]。该标记在石斛属植物研究中已得到初步应用，崔学强等[12]利用iPBS标记对48份石斛兰种质进行种质鉴定和遗传多样性分析，种质间遗传基础较宽，具有较丰富的遗传多样性，DNA指纹图谱可成功区分出48个石斛兰种质；曾艳华等[13]基于iPBS标记对广西乐业县的野生春兰进行遗传多样性研究，81份种质展现出丰富的遗传多样性，种质间基因交流频繁。因此，iPBS标记是是鉴别种质，研究物种遗传关系、遗传多样性，构建指纹图谱的有效方法。但目前未见将iPBS分子标记应用于金钗石斛种质资源鉴定的相关研究报道。

广西地处亚热带，气候温暖、热量丰富、降水丰沛，得天独厚的气候条件与地理环境造就了野生石斛资源非常丰富[2]。过往研究多集中于金钗石斛的药用价值，在遗传学等方面却缺乏研究，了解群体间遗传结构及其遗传多样性，便于制定有效的保护策略。本研究利用iPBS分子标记对取自广西不同县份的金钗石斛居群进行种质资源鉴定以及遗传多样性分析，并构建35份金钗石斛种质的DNA指纹图谱，鉴别居群间遗传关系，揭示居群的遗传多样性，以期为金钗石斛野生种质资源的鉴定与保护提供科学依据。

1 材料与试剂、仪器

1.1材料

35份金钗石斛植物样采集于广西壮族自治区靖西市、那坡县、龙州县、天等县和德保县5个不同地理种群（表1），经广西壮族自治区农业科学院花卉研究所张自斌副研究员鉴定为石斛D. nobile Lindl.，在各样点采集样本时需间隔一定距离（30 m以上），避免克隆株影响研究结果，群体编号分别为JX、NP、DB、LZ、TD。剪取植株幼嫩的健康叶片，装入密封袋并做好标记，保存于冰盒中，及时带回实验室，液氮速冻，保存于‒80 ℃冰箱中，用于基因组DNA的提取。

1.2主要试剂与仪器

EasyPureⓇ Genomic DNA Kit试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），2×Easy TaqⓇ PCR SuperMix（康为世纪生物科技有限公司），Tra-nsⓇ2K DNA Maker（北京全式金生物技术有限公司），50×TAE缓冲液（国拓生物科技有限公司），琼脂粉（上海生工生物工程有限公司）。

H1650-W型常温离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），DYY-6D型电泳仪（北京六一生物科技有限公司），GEL DOCXR全自动凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司），TC-96/G/H(b)C型LifeECO基因扩增仪（杭州博日科技有限公司），HWS-26型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），UV-5500（PC）型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）。

2 方法

2.1基因组DNA的提取和检测

供试样品基因组DNA提取采用EasyPureⓇGenomic DNA Kit试剂盒提取，提取的DNA用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用紫外分光光度计检测其浓度和纯度，提取的DNA用TE缓冲液稀释浓度至20 ng/μL，置于−20 ℃条件下保存备用。

2.2引物筛选及iPBS-PCR扩增

本实验引物选用Kalendar于2010年发表的83条引物[6]，从每个样地中随机选取2份DNA作为样本对iPBS引物进行初步筛选，从合成引物中选取扩增条带清晰，稳定性强，多态性高的引物对供试样品DNA进行PCR扩增。扩增反应总体积为20 μL，包含10 μL 2×Easy TaqⓇ PCR SuperMix，8 μL无菌水，1 μL引物，1 μL模板。iPBS-PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，48 ℃（不同引物的退火温度见表2）退火45 s，72 ℃2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，PCR扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，扩增产物置于4 ℃冰箱保存。

2.3数据统计与分析

观察扩增产物电泳图谱，统计清晰的DNA条带，同一迁移位置上，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，经EXCEL软件构建原始“0/1”二元矩阵。利用NTSYS-pc 2.10e统计软件进行数据分析，采用SHAN Clustering程序进行算数平均数不加权对组法（UPGMA）聚类分析，构建树状聚类图，并用DICE法计算试供材料间的遗传相似系数。使用Popgene 1.32软件计算金钗石斛居群相关遗传多样性参数：平均观测等位基因数（observed number of alleles，Na）、平均有效等位基因数（effective number of alleles，Ne）、Nei’s基因多样性指数（Nei’sgene diversity index，He）以及Shannon多样性信息指数（shannon information index，I）及遗传分化参数：基因多样度（total genetic diversity，Ht）、各居群基因分化系数（gene diversity within population，Hs）、总居群基因分化系数（coefficient of gene differentiation，Gst）、居群间基因流（gene flow，Nm）、遗传一致度和无偏遗传距离，分析其亲缘关系的远近。观察聚类结果，从8条引物中筛选出可单独鉴别35份金钗石斛种质的引物，根据该引物的原始“0/1”矩阵，构建DNA指纹图谱。

3 结果与分析

3.1金钗石斛iPBS引物扩增多态性分析

利用83条iPBS引物对35份金钗石斛种质资源进行PCR扩增，从中筛选出的多态性高、稳定性强且条带清晰的8条引物进行统计分析，结果表明（表2）：8条引物共扩增出158条条带，其中，多态性条带为143条，多态条带百分率（percentage of polymorphic bands，PPB）为90.51%；8条引物扩增出的条带在18～24条，平均每条引物可扩增出19.75条条带，多态性条带为17.88条，各引物多态比率在80.95%～100.00%。表明iPBS引物在35份金钗石斛种质的扩增多态性较高。引物2399对35份金钗石斛种质的扩增电泳图谱如下（图1）。

3.2 不同地区金钗石斛居群聚类分析

利用NTSYS-pc 2.10e的UPGMA法构建35份金钗石斛树状聚类图，在相似系数为0.70处，35份金钗石斛种质可划分为7大类群，Ⅰ类群可划分为2个亚类，第1个亚类为靖西居群的全部物种，第2个亚类为龙州居群的5个植株和天等居群的4个植株；Ⅱ类群和Ⅲ类群皆为那坡居群；Ⅳ类群为天等居群另4个植株；Ⅴ类群和Ⅵ类群皆为德保居群；Ⅶ类群为龙州居群余下的3个植株。聚类图（图2）显示，龙州居群与天等居群未能按照种质来源各自形成独自的类群，而是存在交叉聚集的情况。

利用NTSYS-pc 2.10e计算金钗石斛的遗传相似系数，35份金钗石斛种质间的遗传相似系数变化范围为0.559 0～0.975 9，变幅达0.416 9，均值为0.728 2，表明金钗石斛种质间存在较大遗传差异，遗传基础较宽。其中，靖西居群的遗传相似系数为0.785 3～0.975 9，那坡居群的遗传相似系数为0.640 6～0.908 0，德保居群遗传相似系数为0.559 0～0.863 9，龙州居群遗传相似系数为0.651 2～0.902 9，天等遗传相似系数为0.650 6～0.792 9。从个体水平上看，遗传相似系数最大为.975 9，为靖西居群的J4和J5个体，说明二者亲缘关系最近；遗传相似系数最小为0.559 0，存在于德保居群的DB1和DB5个体间，说明两者亲缘关系最远，遗传差异相对较大。

3.3金钗石斛居群间遗传多样性及遗传分化分析

3.3.1遗传多样性分析采用Popgene 1.32计算金钗石斛居群的遗传多样性参数（表3）。在居群水平上，Na变化范围为1.222 0～1.721 5，平均Na为1.898 7；Ne变化范围为1.184 5～1.447 2，平均Ne为1.505 0；He变化范围为0.106 6～0.259 6，平均值为0.300 7；I变化范围为0.156 9～0.385 5，平均值为0.454 2，即5个金钗石斛居群间的遗传多样性十分丰富。从局群内的遗传多样性来看，靖西为0.156 9，那坡为0.328 2，龙州为0.385 5，天等为0.350 4，德保为0.377 6，龙州金钗石斛居群内的遗传多样性最高，靖西居群最低。根据He和I，5个金钗石斛居群内遗传多样性水平高低顺序依次为龙州>德保＞天等＞那坡＞靖西。

3.3.2遗传分化分析利用Popgene 1.32计算金钗石斛居群相关遗传分化系数。金钗石斛5个居群的Ht为0.299 8，Hs为0.214 9；Gst为0.283 0，说明在5个金钗石斛居群间，有28.30%的遗传变异存在于居群间，71.70%的遗传变异存在于居群内部，局群内的遗传变异明显高于居群间的变异。Nm为1.266 5，Nm＞1，表明居群间的基因交流的水平较高，可有效降低遗传漂变所导致的居群间遗传分化现象，居群间分化程度较低。

3.3.3遗传一致度与无偏遗传距离金钗石斛两两居群间遗传一致度变化范围为0.813 2～0.956 3，均值为0.887 0，遗传距离变化范围为0.044 7～0.206 8，均值为0.121 7，遗传距离数值与遗传一致度恰好相反，遗传一致度最高的2个居群其遗传距离最近。其中，天等居群与德保居群的遗传一致度（0.956 3）最高，且遗传距离（0.044 7）最近，这2个居群的最先聚在一起。靖西居群与那坡居群间的遗传一致度（0.813 2）最低，且遗传距离（0.206 8）最远，居群间差异最大，见表4。

3.435份金钗石斛DNA指纹图谱构建

利用筛选出的8条引物对35份金钗石斛种质进行扩增并构建DNA指纹图谱，经过对比发现，引物2219和2399 2条引物可单独鉴别出35份金钗石斛种质。选取引物2399构建35份金钗石斛品种的DNA指纹图谱，其中，黑方块代表“0，1”矩阵中的1，即该位点有条带；白方块代表“0，1”矩阵中的0，即该位点无条带。利用引物2399对35份金钗石斛构建DNA指纹图谱，如图3所示，此图谱可有效用于35份金钗石斛种质的鉴定与分类。

4讨论

4.1 金钗石斛居群间遗传关系

目前，用于分析物种间遗传多样性及遗传分化的分子标记类型十分丰富，如ISSR、SSR和相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）等。同一物种使用的分子标记不同，得到的遗传多样性结果不同，导致差异出现的原因与分子标记本身的检测特点及其灵敏性有关[14]。张明宇等[15]利用直接扩增片段长度多态性（direct amplification of length polymorphisms，DALP）标记对云南金钗石斛居群进行扩增，多态性比率为72.86%；Bhattacharyya等[16]利用ISSR和基于聚合酶链式反应的小卫星DNA定向扩增（direct amplification of minisatellite region DNA，DAMD）标记对金钗石斛野生种质进行扩增，ISSR的扩增多态性为85.59%，DAMD的扩增多态性为83.67%；杨林秀等[17]利用SSR标记对紫茎泽兰种群进行扩增，多态百分率为71.72%。本研究基于iPBS标记对广西不同地区金钗石斛种质进行扩增，各引物多态比率在80.95%～100%，平均为90.51%，略高于DALP、ISSR、DAMD和SSR标记的鉴定效率，iPBS标记的扩增多态性较高。

遗传距离反映着物种种群间的系统进化，是研究种群遗传多样性的基础[18]，基于遗传距离构建聚类图，可直观反映居群遗传结构上的差异。聚类图谱显示，35份种质清楚地区分开，靖西、那坡和德保居群皆按照种源分散在不同的分支上，有明显地域划分。而龙州和天等2个居群的种质并未出现明显地域划分，不同地点的种质比同一地点的种质先聚集到一起，如LZ1～LZ3、LZ7、LZ8 5个种质先与TD3、TD4、TD6、TD7聚为一类再与余下种质聚集，证明龙州和天等样点的金钗石斛居群间基因交流较为频繁。

4.2 金钗石斛的遗传多样性分析

遗传多样性是生物学研究的核心内容之一，是物种生存进化的基础[19]，研究种群遗传多样性可进一步了解该物种对于环境的适应性以及居群遗传结构，便于开展对濒危物种种质的保护。本研究中，金钗石斛居群水平上的Na、Ne、He和I分别为1.898 7、1.505 0、0.300 7和0.454 2，表明金钗石斛居群间存在较高的遗传多样性。Hamrick等[20]的研究表明，濒危物种的遗传多样性水平普遍较低，但本研究结果显示金钗石斛的遗传多样性较高，可能与其多年生、长寿命、演替和繁殖特点存在一定关联[21]。5个居群内的遗传多样性各不相同，各居群遗传多样性依次为龙州＞德保＞天等＞那坡＞靖西。造成各居群间存在遗传多样性差异的原因可能是各样地的生境不同，虽然样点皆处于南亚热带，但光照、降水、植被覆盖度等环境因子仍存在一定差距，导致同个物种在不同地区呈现不同遗传多样性[22]。通常来说，一个物种的遗传多样性越丰富，其对环境的适应力越强[23]，石斛属植物对生存环境要求较为严格，较高的遗传多样性是金钗石斛更好地适应环境的基础[24]。本研究结果进一步说明，金钗石斛野外种源锐减的原因不在遗传方面，而与人为因素有关。近年来，金钗石斛的野生种质逐年减少，遗传多样性降低，人为影响是主要原因。过度的人为挖采活动导致石斛生境被严重破坏，生境的破碎化加快物种流失，极大地影响了金钗石斛的遗传结构。应加大保护力度，加快优质种的繁殖保育工作，保护野外种源。

4.3金钗石斛居群遗传结构

遗传分化，即居群间与局群内的遗传变异分布格局，是反映居群遗传结构的重要指标[26]。Popgene软件分析结果显示，5个居群的Ht、Hs和Gst分别为0.299 8、0.214 9和0.283 0，总变异的主要来源为居群内部的遗传变异。江爱明等[27]对秦巴山区的石斛居群进行遗传多样性研究，得到Gst为0.934，遗传变异主要来源于居群间；He等[28]对中国西南地区的金钗石斛居群遗传结构进行研究，结果显示群体内变异远大于群体间变异；Yan等[29]对7个金钗石斛居群进行群体分化分析，发现主要变异成分（84.3%）位于个体内，2.3%位于群体间，13.4%存在于群体内；张明宇等[15]对云南金钗石斛居群进行遗传变异研究，居群遗传分化系数为0.338 6，局群内变异占总变异的66.14%；魏丹红等[30]对不同产地的金钗石斛进行遗传研究，结果表明居群内（42.21%）遗传变异略低于居群间（57.79%）。本研究结果显示居群内变异（71.70%）大于居群间（28.30%）。

Nm是指基因在种群内以及种群间交流水平的高低，是影响种群遗传结构的主要因素[21]。过往研究表明，当Nm＞4，居群间基因交流充分，遗传分化极小[31]；当Nm＞1，居群间基因流主要发生均质化作用，基因交流频率较高，可有效防止遗传漂变带来的遗传分化现象[32]，居群间遗传分化不明显；当Nm＜1时，居群间基因交流水平较低，存在遗传漂变带来的遗传分化现象[33]。本研究金钗石斛居群间基因流Nm＞1，群体间存在基因交换，居群间的基因交流水平较高，基因交流会增加遗传变异量从而降低居群分化程度。居群间基因交流频繁的原因可能与其繁殖方式和地理距离远近有关[34]，兰科植物的种子具有远距离传播的能力[35]，成熟的花粉会随风传播，这可能是基因交流的主要形式。

4.4金钗石斛的DNA指纹图谱构建

DNA指纹图谱是通过特定分子标记技术对种质进行处理，将不同个体的特定片段显示出来[36]，以此构建物种的“数字化身份证”，便于区分同一种群的不同个体。构建物种的DNA指纹图谱，可以改变以往依赖表型性状鉴别种质的局面[37]，有效提高种质的利用效率。本研究基于引物2399构建35份种质的DNA指纹图谱，图谱显示，各个种质间皆存在位点差异，可凭借该图谱有效鉴别35份金钗石斛种质。研究证明，iPBS标记可有效应用于金钗石斛种质遗传多样性和遗传分化研究中，是构建DNA指纹图谱的有效手段。但单一标记鉴定可能存在偏差，后续试验可将不同分子标记应用于金钗石斛的遗传多样性鉴定中，进行对比研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：赵秋菊，崔学强，邓杰玲，黄昌艳，欧美景，李红燕，张自斌．金钗石斛居群遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建 [J]. 中草药, 2023, 54(19):6434-6442.