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野生珍稀药用植物七叶一枝花的成分含量分析

花匠小妙招
2025-05-15 02:44

福建七叶一枝花组织培养及主效成分测定

收稿日期:2021-05-17基金项目:福建省星火项目(2020S01020041);福建省三明市科技项目(2019-N-2)作者简介:罗晓锋(1979 ),男,硕士,助理研究员,从事药用植物研究工作㊂通信作者:周建金,E-mail:55176609@㊂文献著录格式:罗晓锋,周建金,叶炜,等.福建七叶一枝花组织培养及主效成分测定[J].浙江农业科学,2021,62(7):1398-1401.DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.20210741福建七叶一枝花组织培养及主效成分测定罗晓锋,周建金∗,叶炜,乔锋,廖承树(三明市农业科学研究院,福建沙县㊀365500)㊀㊀摘㊀要:本研究以福建七叶一枝花的小苗㊁根㊁带柄叶为外植体,采用组织培养和HPLC 法,开展组织培养及主效成分测定研究㊂结果表明:(1)不同外植体类型,通过诱导培养基1/2MS +6-BA 2.0mg㊃L -1+2,4-D1.0mg㊃L -1,均能成功诱导出愈伤或丛生芽,但不同外植体类型诱导率差异明显㊂以小苗诱导率显著最高,为58.33%;(2)不同增殖途径对组培的影响很大,愈伤组织途径的绝对生长速率㊁相对生长速率㊁增殖率均显著高于丛生芽途径;(3)福建七叶一枝花组培过程中,产生的根㊁块茎㊁愈伤组织均含有重楼皂苷成分,根部的总皂苷含量达0.342%,愈伤组织达0.339%,块茎的总皂苷含量最高,达0.497%㊂3个部位的4种皂苷成分中,以重楼皂苷Ⅶ占绝对优势,其余3种皂苷含量极低或未检出㊂通过对福建七叶一枝花组织培养及皂苷含量测定,初步建立了福建七叶一枝花组织培养体系,证实了通过组织培养获得次生代谢物的可行性,为生产福建七叶一枝花组培苗和次生代谢产物奠定了基础㊂关键词:福建七叶一枝花;组织培养;HPLC;重楼皂苷含量中图分类号:S567㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:0528-9017(2021)07-1398-04㊀㊀2015年版‘中国药典“规定,中药重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis (Franch.)Hand.-Mazz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis (Franch.)Hara 的干燥根茎[1]㊂七叶一枝花的主要有效成分是甾体皂苷,其皂苷元主要为异螺甾烷醇类的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元[2]㊂现代药理研究表明,七叶一枝花具有抗肿瘤㊁止血㊁止咳平喘㊁抗菌㊁抗病毒㊁避孕等作用,其良好的疗效被众多的制药工业应用,是云南白药㊁宫血宁㊁热毒清等重要中成药的主要成分,用途极为广泛[3-5]㊂由于近年重楼药材供需矛盾突出,七叶一枝花已被列为国家重点保护野生药材濒危物种[6-7]㊂因此,积极开展七叶一枝花组织培养是解决当前重楼药材严重短缺和更好地保护其野生植物资源的有效方法㊂然而到目前为止,关于七叶一枝花植物的组织培养还未取得实质性进展[8-12]㊂本研究以福建七叶一枝花的小苗㊁根㊁带柄叶为外植体,开展组织培养工作,以期利用组织培养技术有效解决福建七叶一枝花种苗繁育的瓶颈问题,为生产七叶一枝花植物次生代谢产物提供参考㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料七叶一枝花采自福建省三明市沙县大佑山,海拔900m,在2 3月,取1a 生的整株植株带土挖取,置于自封袋内带回实验室㊂重楼皂苷含量检测采取七叶一枝花组培苗组培过程中,产生的愈伤组织㊁根系和块茎㊂重楼皂苷Ⅰ对照品(111590-201604)㊁重楼皂苷Ⅱ对照品(111591-201604)㊁重楼皂苷Ⅵ对照品(111592-201604)㊁重楼皂苷Ⅶ对照品(111593-201604)均购自中国食品药品检定研究院㊂乙腈㊁甲醇为色谱纯;水为双蒸水㊂其他试剂均为分析纯㊂Waters 2695高效液相色谱仪;WND200型粉碎机;EX1252H 电子天平㊂1.2㊀方法1.2.1㊀七叶一枝花外植体消毒和诱导㊀㊀选取七叶一枝花的整株小苗㊁根㊁带柄叶为外植体㊂在超净工作台上先将各外植体经70%乙醇消毒30s,再用0.1%升汞溶液消毒6~8min,无菌水冲洗待用;将消毒完成的外植体接种于1/2MS +6-BA2.0mg㊃L-1+2,4-D1.0mg㊃L-1培养基㊂不同类型的外植体各接种60个,20个为1个重复,重复3次㊂每个诱导培养80d,有长出愈伤组织㊁隐芽的外植体,属诱导成功,并换算诱导率㊂外植体诱导率=100%ˑ产生愈伤㊁隐芽的外植体数/接入外植体总数㊂1.2.2㊀七叶一枝花增殖分化与生根培养㊀㊀将长出的愈伤组织㊁侧芽接入分化培养基1/ 2MS+6-BA2.0mg㊃L-1+IAA1.0mg㊃L-1中培养㊂分化出小苗,既切下转接生根培养基1/2MS+NAA 0.3mg㊃L-1中培养㊂未分化的继续增殖分化培养㊂待有足够的增殖数量后,进行统计分析㊂转接时1瓶接4块,称重,转接60d后,统计增殖率㊁绝对生长速率和相对生长速率㊂以上处理5瓶为1个重复,重复3次㊂以上培养条件为温度(20ʃ2)ħ,光照时间12h㊃d-1,光照度1000~1500lx㊂1.2.3㊀重楼皂苷含量测定㊀㊀参照2015版‘中国药典“测重楼皂苷的方法[1],对七叶一枝花组培的块茎芽㊁根系㊁生根苗,进行重楼皂苷含量的测定㊂色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按表1中的规定进行梯度洗脱;检测波长为203nm㊂进样量10μL;检测波长205nm;柱温25ħ;流速为0.8mL㊃min-1㊂表1㊀梯度洗脱程序时间/min流动相A/%流动相B/%0~4030ң6070ң4040~5060ң3040ң70㊀㊀对照品溶液的制备㊂分别精密称取重楼皂苷Ⅰ㊁Ⅱ㊁Ⅵ㊁Ⅶ对照品适量,置25mL量瓶中,加甲醇制成每1mL中含重楼皂苷1㊁重楼皂苷Ⅱ㊁重楼皂苷Ⅵ㊁重楼皂苷Ⅶ分别为0.3667㊁0.3383㊁0.3456㊁0.3267mg的混合溶液,摇匀,作为混合对照品溶液㊂供试品溶液的制备㊂取组织培养过程中的根㊁块茎㊁愈伤组织适量,粉碎成末(过3号筛),每份精密称定0.5g,重复3次㊂置具塞锥形瓶中,精密加入乙醇25mL,称定重量,加热回流30min,冷却后再称定重量,用乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液即得㊂1.2.4㊀线性关系考察㊀㊀分别精密吸取上述混合对照品溶液0.1㊁0.2㊁0.3㊁0.4,0.5mL,置1.5mL的进样量瓶中,加甲醇至1mL,即得每1mL中含重楼皂苷Ⅰ分别为0.03667~0.1833mg,重楼皂苷Ⅱ分别为0.03383~ 0.1692mg,重楼皂苷Ⅵ分别为0.03456~0.1728 mg,重楼皂苷Ⅶ分别为0.03267~0.1634mg的系列标准溶液,按2.1节色谱条件进样,记录峰面积,以质量浓度(x,mg㊃mL-1)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标,进行线性回归㊂1.2.5㊀样品测定㊀㊀按上述色谱条件进样测定,记录液相色谱图,并计算平均含量㊂2㊀结果与分析2.1㊀不同类型外植体的诱导情况外植体在消毒接种3d后部分出现污染㊂消毒成功的小苗15d后在块茎部位出现不同程度的膨大,30d后叶片枯萎,现出隐芽和愈伤组织㊂根系和带柄叶接种后,60d后在断口处长出愈伤组织(图1)㊂a 小苗消毒接入诱导培养基;b 小苗叶片枯萎,块茎膨大,现出侧芽;c 根部断口膨大长出愈伤组织;d 叶柄断口膨大长出愈伤组织㊂图1㊀七叶一枝花外植体诱导从表2可以看出,采用乙醇加升汞的方法能有效杀死外植体的菌类㊂根部染菌率最低,为10%;带柄叶染菌率最高,为50%,因此,可适当增加消毒时间降低带柄叶的污染㊂不同外植体类型,通过诱导培养基:1/2MS+6-BA2.0mg㊃L-1+2,4-D 1.0mg㊃L-1,能成功诱导出愈伤或隐芽,但不同外植体类型诱导率差异明显㊂以小苗诱导率显著最高,为58.33%,根和带柄叶诱导率差异不明显㊂因此,福建七叶一枝花组织培养的外植体建议采用小苗㊂表2㊀不同类型外植体对七叶一枝花组培诱导的影响外植体类型接种外植体数染菌率/%诱导率/%小苗2025.0058.33ʃ7.64a 根2010.0015.00ʃ5.00b 带柄叶2050.0010.00ʃ5.00b ㊀㊀注:同列无相同字母表示处理间差异显著(P<0.05)㊂表3同㊂2.2㊀增殖与生根由图2可知,将诱导出的愈伤组织㊁侧芽转接分化培养基1/2MS+6-BA2.0mg㊃L-1+IAA1.0mg㊃L-1培养,能完成正常的增殖和分化过程;将分化的小苗转接于生根培养基1/2MS+NAA0.3mg㊃L-1中,则小苗块茎变粗壮,并产生大量根系㊂a 丛生芽增殖;b 丛生芽分化成小苗;c 愈伤组织增殖与分化成芽;d 分化苗生根㊂图2㊀七叶一枝花增殖与生根培养从表3中可以看出,不同增殖途径对组培影响很大㊂丛生芽途径的绝对生长速率㊁相对生长速率㊁增殖率均显著低于愈伤组织途径㊂不同增殖途径不影响小苗的生根,因此,福建七叶一枝花组织培养建议采用愈伤组织途径㊂表3㊀不同组培途径对增殖的影响组培途径绝对生长速率/%相对生长速率/%增殖倍数生根率/%丛生芽途径60.09ʃ4.45b187.33ʃ6.03b2.12ʃ0.12b100.00愈伤组织途径150.01ʃ10.70a308.00ʃ13.75a3.52ʃ0.10a100.00 2.3㊀标准曲线结果按2.1节色谱条件进样,得到如图3的重楼混合对照液的HPLC色谱图㊂记录峰面积,以质量浓度(x,mg㊃mL-1)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标,进行线性回归,得到如图4的标准曲线㊂从图4中可以看出,皂苷Ⅰ㊁Ⅱ㊁Ⅵ㊁Ⅶ的R2值分别为0.9989㊁0.9972㊁0.997㊁0.9978,表明线性条件良好,可作测量样品的标准曲线来使用㊂1 重楼皂苷Ⅶ;2 重楼皂苷VI;3 重楼皂苷Ⅱ;4 重楼皂苷Ⅰ㊂图3㊀重楼对照品HPLC色谱图4㊀标准曲线2.4㊀不同组培产物的皂苷含量分析七叶一枝花的主效成分为甾体皂苷㊂从表4和图5可以得出,组培过程中,福建七叶一枝花产生的根㊁块茎㊁愈伤组织均含有重楼皂苷成分,根部的总皂苷含量达0.342%,愈伤组织达0.339%,块茎的总皂苷含量最高,达0.497%(2015版药典要求0.6%)㊂3个部位的4种皂苷成分中,以偏诺皂苷皂苷Ⅶ占绝对优势,其余3种皂苷含量极低或未检出㊂表4㊀组培中不同部位的皂苷含量检测部位皂苷Ⅰ/%皂苷Ⅱ/%皂苷Ⅵ/%皂苷Ⅶ/%总皂苷含量/%根--0.0030.3380.342块茎0.0100.110-0.3770.497愈伤组织0.0100.064-0.2650.339㊀㊀注:-表示未检出㊂图5㊀福建七叶一枝花组培过程中不同部位的HPLC色谱图3㊀讨论3.1㊀七叶一枝花组织培养组培快速繁殖技术是解决七叶一枝花种苗问题的重要途径㊂本文在对七叶一枝花组培的过程中发现,在适宜时期选择有效外植体部位非常重要㊂本研究中所采用的小苗㊁根㊁带柄叶为外植体,均能成功诱导出愈伤或隐芽,但不同外植体类型诱导率差异明显㊂以小苗诱导率显著最高,为58.33%,而且产生的愈伤组织和丛生芽数量也更多,生长质量也更好,因而也确保了后继的成功增殖㊂本研究也曾采用了除第一节根茎以外的其他根茎作为外植体进行愈伤组织诱导,但最终都未获得愈伤组织,这与胡天印等[11-12]的研究结果相似㊂因此,七叶一枝花顶芽保持有较强的潜在分裂能力,细胞经诱导培养后较易脱分化产生愈伤组织或丛生芽,而本文采用没有伤口的整株小苗,既能减少顶芽在消毒时受到伤害,又能为顶芽块茎生长提供营养,只是如何加快愈伤组织或丛生芽的诱导速率㊁正确引导愈伤组织或丛生芽快速增殖,是建立福建七叶一枝花组织培养体系的关键㊂3.2㊀七叶一枝花组培生产次生代谢产物李恒[8]在重楼属植物的书中提到,重楼愈伤㊀㊀组织生长缓慢,检测出不含重楼皂苷㊂本研究重楼皂苷作为七叶一枝花植物中的最主要的有效成分,属于植物的次生代谢产物㊂经多次继代培养的福建七叶一枝花丛生芽和愈伤组织,是可以在产生大量初生代谢产物的基础上,进一步产生重楼皂苷次生代谢物㊂因此,通过组织培养生产重楼次生代谢产物是一种可行的㊁具有应用潜力的生物技术途径㊂在七叶一枝花植物以后的组织培养研究过程中,是否可通过改变培养基中各成分的种类㊁比例,提高愈伤组织的增殖率和皂苷含量还有待进一步研究㊂本研究以福建七叶一枝花的小苗㊁根㊁带柄叶为外植体,开展组织培养和皂苷含量测定研究,初步建立了福建七叶一枝花组织培养体系,证实了通过组织培养获得重楼皂苷次生代谢物的可行性,为繁殖福建七叶一枝花种苗提供新途径,同时也为生产七叶一枝花植物次生代谢产物奠定了工作基础㊂参考文献:[1]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:化学工业出版社,2015:260.[2]㊀张晓洁,查岭生,陈小静,等.一株产重楼皂苷内生细菌的分离与鉴定[J].微生物学通报,2006,33(5):84-88.[3]㊀汤海峰,赵越平,蒋永培.重楼属植物的研究概况[J].中草药,1998,12(29):839-842.[4]㊀唐炳兰.中药重楼的研究进展[J].右江民族医学院学报,2006(6):1062-1064.[5]㊀张霄霖,刘月蝉.重楼的研究与应用[J].中国中医药科技,2000,7(5):346-347.[6]㊀马云淑,桂镜生,朱燕,等.滇产重楼资源及市场情况调查[J].云南中医学院学报,1997,20(2):24-26. [7]㊀钟廷瑜,舒光明,易尚平.四川重楼属药用植物资源研究[J].资源开发与市场,1998,1(45):202-205.[8]㊀李恒.重楼属植物[M].北京:科学出版社,1998:1-7.[9]㊀李群,陈丽萍,葛方兰.重楼属植物愈伤组织的诱导和培养[J].四川师范大学学报(自然科学版),2006,29(1):120-122.[10]㊀杨丽云,陈翠,吕丽芬,等.云南重楼的组织培养与植株再生[J].植物生理学通讯,2008,44(5):947-948. [11]㊀胡天印,钱丽华,刘汉卿.濒危植物延龄草愈伤组织诱导研究[J].浙江师范大学学报(自然科学版),2006,29(3):326-329.[12]㊀王跃华,陈燕,张珏等.华重楼愈伤组织培养及薯蓣皂苷含量测定[J].湖北农业科学,2014,8(53):1936-1940.(责任编辑:张瑞麟)。