荷叶铁线蕨配子体发育及性器官分化过程中DNA甲基化研究
荷叶铁线蕨配子体发育及性器官分化过程中DNA甲基化研究-观赏园艺专业论文
华中农业大学2016届硕士研究生学位论文3．1．2双酶切及预扩增结果 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 3．1．2双酶切及预扩增结果23 3．1．3选扩结果分析．24 3．2测序结果分析．．32 3-3相关基因CpG岛预测．33 3．4 S2P家族蛋白和WRKY转录因子qRT．PCR表达34 4．讨{仑36 4．1实验体系构建．．36 4．2荷叶铁线蕨配子体发育及性器官分化中DNA甲基化分析36 4．3 S2P家族蛋白和WRKY转录因子的分析．36 4．4 S2P家族蛋白和WRKY转录因子实时定量．37 5．结论38 5．1结论．38 5．2展望38 参考文献40 致谢．．45 II 万方数据 荷叶铁线蕨配子体发育及性器官分化过程中DNA甲基化研究摘要 荷叶铁线蕨配子体发育及性器官分化过程中DNA甲基化研究 摘要 现今对表观遗传的研究不仅涉及动物，也深入到植物方面，表观遗传研究机理 中常见的一种为DNA甲基化，主要集中研究在全基因组水平上的DNA甲基化研究 及特异性基因各种甲基化与去甲基化作用上。研究全基因组DNA甲基化广泛使用 的是甲基化敏感扩增多态性分析(简称MSAP)的方法，这种方法能够从一定水平 上准确推测出全基因组甲基化程度，并根据测序结果发掘出有用目的基因，进行后 续功能验证反应。MSAP技术主要使用2种同裂酶(对甲基敏感程度不同)切割基 因组DNA，通过选择性扩增等PCR反应，分析判断全基因组DNA甲基化程度。荷 叶铁线蕨在叶片、株型方面有较高的观赏价值，是蕨类中二级珍稀孑遗植物。由于 其较高的观赏价值，目前对其在家庭、花卉市场等领域的应用加深，近年来对荷叶 铁线蕨的研究越来越多。但是由于起步迟，且荷叶铁线蕨一般位于深山岩石等处， 所以对它的研究从引种开始，研究其快繁体系。对于分子方面研究刚开始起步。 本实验选取荷叶铁线蕨无性和有性生殖中各三个时期的样品，做MSAP分析。 经MSAP技术分析结果表明，在荷叶铁线蕨无性生殖及有性生殖中存在频繁的DNA 甲基化现象，并且随着性器官的分化及分生组织的产生，甲基化水平明显增高，而 随着孢子体分化的产生，甲基化水平又开始降低，但比率仍然较高：研究还说明了 随着荷叶铁线蕨的生长发育，还发生了明显的超甲基化及去甲基化现象，在不同时 期中都表现出一定的特异性，这从一定程度上说明DNA甲基化程度差异性与荷叶 铁线蕨的不同时期生长发育有关联性：经过测序比对，筛选出2种差异基因，即S2P 家族蛋白及WRKY转录因子。对这两种基因进行CpG岛预测，发现S2P不存在CpG 岛，但GC含量达到55％；WRKY转录因子中存在两个CpG岛，GC含量达到80％。 并通过荧光实时定量计算这2种基因在6个不同发育时期中的不同的表达量，发现 S2P在无性生殖孢子体形成阶段表达量最高，S2P序列来自于无性孢子体选择性扩 增切胶所得，推测S2P的甲基化和无性孢子体形成可能有着重要作用：WRKY转录 因子在有性生殖孢子体形成及无性生殖分生组织分化时期表达量较高，WRKY序列 来自于有性孢子体形成时期选择性扩增切胶所得，推测WRKY转录因子的甲基化和 有性孢子体的形成可能有重要作用。 关键词：配子体发育，性器官分化，MSAP技术，生物信息学分析，qPCR 万方数据 华中农业大学2016届硕士研宄生学位论文ABSTRCT 华中农业大学2016届硕士研宄生学位论文 ABSTRCT Nowadays，the study of epigenetie involves not only animals also plants，one of the common mechanism of epigenetic studies is DNA methylation，mainly researching on the whole genome level of DNA methylation research and specific gene methylation and Bse of methylation．The whole genome DNA methylation study widely uses the method of Methylation-Sensitive Amplification Polymorphism analysis(MSAP)，this method carl accurately estimate the whole genome degree of methylation from a certain level，and according to the gene sequencing results finds useful target ge
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