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项目文章

花匠小妙招
2024-09-26 07:55

基因组测序揭示了桃地方品种红花性状候选基因

影响因子：8.7

期刊：Horticulture Research

时间：2023年10月

单位：福建省农科院

2023年10月，福建省农科院果树所于Horticulture Research发表了题为“Genome sequencing revealed the red-f lower trait candidate gene of a peach landrace”的研究论文，该研究对红花地方品种“鹰嘴”（简称“RedY”）的二倍体基因组进行了测序和组装，对“RedY”红色花瓣的多组学分析显示，红色增强与花青素积累和黄酮醇同时下降有关。这种现象可能归因于黄酮醇合成酶（FLS），其具有9-bp外显子插入。而且这种FLS变体的纯合等位基因构型仅在红花桃中观察到。此外，收集桃种质资源的全基因组关联研究（GWAS）中，9-bp序列变异与粉红/红色花瓣颜色密切相关。从原核表达系统中纯化的FLS变体的功能分析表明，其在黄酮醇生物合成中的酶活性降低，与红花的主要性状一致。因此，FLS天然变异体被认为是桃红花性状的最佳候选基因。这为未来的桃育种工作提供了有价值的见解。迈维代谢提供了花青素代谢组的检测分析服务。

研究背景

桃（）是一种重要的经济作物，也是基因组研究的理想材料，虽然桃栽培品种和野生近缘种的性状相关基因研究取得了很大进展，但桃地方品种中控制重要性状的新基因（如红花基因）仍不清楚。

技术路线

研究结果

1.染色体水平和单体型分辨的基因组组装和特征分析

基于PacBio高保真（HiFi）测序和高通量染色质构象捕获（Hi-C）测序读数组装桃地方品种“RedY”的高质量染色体水平基因组（表1，图1）。将总共15 Gb的PacBio HiFi读段（代表60倍测序覆盖率）组装成两个单倍型分辨的重叠群水平基因组，其由145个和122个重叠群组成，N50值分别为16.7 Mb和25 Mb。利用67-Gb的Hi-C数据，将145个和122个重叠群锚定在8条染色体上，得到两个最终的单倍型分辨组装体，其总长度分别为242.77 Mb和247.40 Mb。利用Circos作图法对每个单倍型的基因密度、GC含量和重复序列密度等染色体尺度信息进行可视化。两个单倍体组装体都显示出与广泛研究的Lovell v2.0桃基因组的高度共线性（图1）。

表1 从头基因组测序和组装总结

图1 桃“RedY”基因组特征

总体而言，使用从头预测、转录组定位和同源性搜索方法，对两种单倍型的29249和29431个假定基因进行了注释。超过93.87%的已用于基因注释的Illumina RNA-Seq干净读段可被映射到二倍体基因组。BUSCO对RedY基因组（包括两个单倍型）的注释完整性估计为99.1%。分析表明，重复序列占组装基因组的36.48%，其中以长末端重复反转录转座子（LTR-RT）最多，占总重复序列的53.5%。其中，LTR-RT元件的两个主要分支Ty 1/Copia和Ty 3/Gypsy，覆盖二倍体基因组的4.87%和7.01%，其他DNA转座子占基因组序列的18.02%。Kimura距离表明LTR-RT活动爆发为6.75 Mya。

2.'RedY'红色花与'PinkY'粉色花花色苷和黄酮醇的含量变化存在差异

随着第一个红花桃基因组的组装，“RedY”花红色化的原因引起了人们的特别关注。为了进一步阐明花瓣着色过程，作者从“RedY”和“PinkY”（粉色鹰嘴桃）中收集了代表不同形态特征和发育状态的四种花卉样本（S1-S4）进行解剖观察（图2）。在花瓣萌发前的S1阶段，平行样品中发现了浅色。然后，初级花瓣着色过程开始从尖端和边缘，直到它蔓延到整个花瓣。相比于“PinkY”，“RedY”花瓣的全色素沉着出现较早，花瓣更密集。在S3和S4阶段，观察到“RedY”和“PinkY”花瓣之间的红色着色强度存在明显差异；因此，选择颜色明显变化的花瓣样品（即R3和P3，R4和P4）用于色素物质测定。

图2 “RedY”和“PinkY”花样的形态特征和发育状态

先前的研究表明，桃花瓣颜色的差异与花青素含量水平的变化有关。此外，用于平行黄酮醇合成的竞争性底物减轻了花瓣的色素沉着。因此，作者测定了“RedY”和“PinkY”的对比色样品R3、R4、P3和P4中主要花青素和黄酮醇组分的含量（图3）。结果表明，“RedY”花色素苷代谢产物的量显著高于“RedY”（R3 vs P3，R4 vs P4），根据计算结果，远远超过其他花青素衍生物，占花青素代谢物的一半以上的Cy-3-Glu（矢车菊素-3-O-葡萄糖苷），在“RedY”中的丰度比“PinkY”高4倍。相反，“RedY”的黄酮醇含量比“PinkY”有所下降。代谢组学结果表明，花青素积累的增强伴随着黄酮醇产量的大幅下降，与“RedY”花瓣的红色增强有关。

图3 相应生物合成途径中主要花青素和黄酮醇苷含量。在该图中，①②代表了类黄酮生物合成途径中色素产物的两个重要分支。4CL，4-香豆酸：辅酶A连接酶；ANR，花青素还原酶；C4H，肉桂酸4-羟基酶；CHI，查尔酮异构酶；CHS，查尔酮合成酶；DFR，二氢黄酮醇还原酶；F3H，黄烷酮3-羟基酶；F3’H，黄酮类3-羟基酶；FLS，黄酮醇合成酶；GST，谷胱甘肽S转移酶；LAR，亮氨酸花青素还原酶；LDOX，亮氨酸双加氧酶；PAL，苯丙氨酸解氨酶；UGTs，辅基转移酶

3.花青素和黄酮醇组成丰度变化相关基因的筛选

在桃子中，组织的红色色素沉着已被深入研究，并且基于组学证据和红色色素沉着参与的实验验证，从其复杂基因家族中鉴定了花青素苷和黄酮醇生物合成的最关键基因及其重要的调控转录因子。因此，作者将重点放在筛选到的53个基因上，这些基因对应于上述报道的花青素/黄酮醇相关的生物合成或修饰基因和特定的MBWs复合物调节因子。作者分别将收集的花瓣样品的转录组测序结果与“RedY”基因组进行比对，并计算基因表达水平。对所选基因的研究结果表明，在红-粉红色花瓣比较中（R3 vs P3和R4 vs P4），报道最多的花青素/黄酮醇相关生物合成基因（）和转录调节因子（PpbHLH3, PpWD40, PpHYH, PpHY5, PpCOPs, PpMYB10s, PpMYBPA1, PpMYBF1, Peace, PpMYB17-20和 PpMYB108）在红色花瓣中没有显示出比粉红色花瓣更高的转录表达水平。此外，这些被选择的基因在两种粉-红色花瓣的比较中没有表现出一致的变化趋势。通过qRT-PCR验证也证实了特定基因的表达变化趋势，这表明它们与转录组学分析一致。

除了转录组学的初步比较结果之外，对所有收集的样品中花青素/黄酮醇量与调节MBWs表达水平之间的相关性的分析也显示，Pearson相关系数的绝对值低于0.7，这表明相关性不足。结合这两个结果，作者发现选择的结构基因和MBWs的表达变化不太可能解释红色-粉红色的花瓣中花青素/黄酮醇含量的变化。

随后，作者对颜色对比样品进行了比较转录组分析，在R3与P3和R4与P4比较中分别产生了969和1336个差异表达基因（DEG）。与粉红色花瓣相比，红色花瓣中存在24种上调和82种下调的DEGs。106个常见DEGs的GO和KEGG注释没有发现任何可能与花青苷/黄酮醇途径相关的推定基因。通过分析常见的DEG，单萜类化合物生物合成、抗坏血酸盐和醛糖二酸盐代谢是显著富集的代谢途径。综上所述，没有证据表明花色素苷/黄酮醇相关结构基因的表达变化与花色素苷/黄酮醇含量变化有关。

除了转录调控之外，结构或调控基因的遗传变异可能会影响代谢物的产生或积累。在检查“RedY”注释的基因/蛋白质与从先前的桃花青素/黄酮醇研究中检索的53个上述花青素/黄酮醇相关基因/蛋白质的比对结果后，发现并鉴定了一种新的“RedY”特异性FLS（黄酮醇合成酶）变体，其第二外显子插入9-bp，第一内含子插入300-bp，而其他功能基因/蛋白在核苷酸和推导的氨基酸序列上都显示出高度相似性。FLS变异示意图如图4所示。将该FLS变体在非冗余蛋白数据库（NCBI host）中进行比对，在桃和其他物种中均未发现类似的氨基酸插入，表明GLQ（Gly-Leu-Gln，由9-bp外显子插入物编码）的插入形成了GLQ重复序列，其在植物界中产生了稀缺的FLS变体。考虑到在所有研究的FLS蛋白中存在保守的GLQ基序，暗示其可能的重要作用，FLS的GLQ重复变异可能影响酶活性。随后初步选择了FLS变异作为花青素或黄酮醇丰度变化的候选基因。

图4 “RedY”特异性FLS变体的核苷酸和推断的氨基酸序列。一个9-bp的插入在“RedY”来源的黄酮醇合成酶(peach05454)中建立了一个新的GLQ (Gly-Leu-Gln)重复

4.粉红花桃和红花桃FLS的变异验证和基因分型

与先前研究的FLS基因（Prupe.1G502800，Lovell v2.1）相比，在当前FLS基因变体中发生了两个不同的插入，一个在内含子1中，另一个在外显子2中。作者对168个粉红花桃和23个红花桃的验证结果表明，在一些粉红花桃和所有红花桃中存在300-bp的内含子插入。这一观察结果使得300-bp的内含子插入不太可能是导致红花性状的候选基因。另一方面，在所有红桃中都观察到显性的9-bp外显子插入，这表明9-bp外显子插入与红花特性的潜在关联。

根据两次插入的验证结果，确定了至少三个FLS等位基因（F1，F2和F3）。其中，F3等位基因/变体包含两个插入，而F2等位基因具有300-bp内含子插入，而F1等位基因没有插入（图5）。值得注意的是，含有9-bp外显子插入（F3F3）的纯合子基因型仅在红花桃中发现。作者用FLS等位基因对169株粉红花桃和23株红花桃进行了分型，证实了F3F3等位基因型只存在于红花桃中，而其他基因型则出现在粉红花桃中。这表明基因型F3 F3与红花性状特异相关。

图5 在桃红桃中检测到3个FLS等位基因。F1、F2、F3为FLS等位基因的三种类型。与F1相比，F2含有300-bp的内含子插入，而F3（指FLS变体）同时含有300-bp的内含子插入和9-bp的外显子插入。F1和F2在粉红花桃中可以鉴定，F3主要存在于红花桃中

5.FLS变异体是桃红花性状的最佳候选基因

红花表型以前被报道为一种由隐性位点决定的质量性状。利用“RedY”高质量的单倍体基因组和桃重测序数据，进行GWAS分析，以研究SV（包括SNP和InDel）与花瓣颜色表型的全基因组关联。基于P < 1E-20的阈值线，仅在1号染色体上发现了显著的关联峰。与红花表型最强相关的顶部相关SV定位在FLS的外显子2中（图6）。这是一个9-bp的InDel变异的FLS序列，导致GLQ（GlyLeu-Gln）的存在/不存在的氨基酸序列，这与目前的研究结果是一致的。除此定位的FLS（peach05454，RedY）外，其他关联峰的相邻高关联SV均分布在基因间区域，SV相邻基因与花青素/黄酮醇途径无关。因此，基于红花表型和序列方差之间的最高关联，将某些FLS（peach05454，RedY）鉴定为决定红花性状的最佳候选基因。

值得注意的是，除了peach05454之外，由串联重复基因编码的三种推定蛋白质（peach05450、peach05451和peach05453）与功能性AtFLS1（由拟南芥AT5G08640编码）显示出49%至59%的相似性。然而，这三个串联基因在根、幼叶和成熟叶、花、外果皮和中果皮中几乎未检测到表达，表明peach05450、peach05451或peach05453被沉默或抑制，其中peach05454是表现出一定FLS功能的优势基因。因此，考虑到InDel变异在GWAS中的基因组定位及其主基因地位，作者认为FLS变异可能有助于红花性状的单基因遗传。

图6 曼哈顿图

6.FLS原核表达及功能研究

由于无论是否存在300-bp内含子插入变异，F1和F2等位基因FLS都被转录并翻译成相同的FLS蛋白，因此，作者研究并比较了FLS（由F1/F2等位基因编码）和FLS变体（由F3等位基因编码）之间的酶活性。结果表明，从埃希氏菌表达系统中纯化的FLS变体在将二氢山奈酚转化为山奈酚中的催化活性降低。令人印象深刻的是，由于蛋白质序列中的GLQ插入，酶活性在FLS变体中从20.62降低到4.14，降低了78.66%（图7）。以上研究结果共同指向这样一个事实，即FLS变体的存在显着削弱了其促进黄酮醇合成的能力。因此，这种黄酮醇合成能力的降低可能会对桃花瓣中黄酮醇和花青素之间的微妙平衡产生影响。

图7 FLS的催化反应

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