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基于基因组组装发掘茉莉花香气形成与花色素代谢调控机制

花匠小妙招
2025-05-22 20:54

茉莉[Jasminum sambac(L.)Aiton]为木樨科素馨属的一种直立或攀援型灌木,花朵洁白,香气馥郁优雅,不仅常用于景观盆栽,还是用于制作茉莉花茶的主要原料,具有重要的应用与经济价值。茉莉花尚未发育成熟时花瓣为绿黄色,无明显香气,而成熟花苞的花瓣转为白色,并在当天夜间开放释香。在茉莉花茶实际生产过程中,从业者需根据茉莉花开放过程中花瓣转色的表型特征,依赖经验采摘成熟的白色花苞,在一定的温湿度条件下保证离体茉莉花在当天夜晚开放释香。同时,在茉莉花开放一天内,花瓣又会再次转黄,此时花香显著降低。茉莉花开放过程中香气与色素组分积累是否存在竞争碳通量的关系尚不明确。茉莉花能否最大限度的释放香气是决定茉莉花茶香气品质的关键环节。因此,为了高效利用茉莉花香气物质,亟需解析茉莉花发育过程中香气合成及花色素代谢的调控机制与联系。迄今,有关茉莉花香气的研究主要集中在代谢水平,而茉莉花瓣色素的代谢基础与调控机制方面的研究仍为空白。本研究测序并组装了染色体级别的高质量茉莉花基因组,并对茉莉花基因组特征进行系统解析,深入分析与关键香气物质合成相关基因家族。在此基础上,结合代谢组、转录组及Small RNA测序技术系统分析茉莉花香气合成及花色素代谢的分子调控机制,并利用一系列现代分子生物学技术对关键基因与micro RNA(miRNA)进行功能表征。主要研究结果如下:(1)高质量茉莉花参考基因组组装与基因功能注释。以福州单瓣茉莉花(J.sambac var.unifoliatum cultivar‘Fuzhou single-petal’,JSU-FSP)为材料,整合Illumina测序、Pacbio测序以及高通量染色质构象捕获技术,组装获得495.60 Mb参考基因组。其中,基因组组装的contig N50达16.88 Mb,96.23%的序列被挂载至13个假定染色体。基因注释结果表明,该基因组包含30,989个蛋白编码基因,其中2,333个为转录因子基因,分属于58个家族。基因组内含有245.18Mb重复序列,其中长末端重复序列-反转录转座子(LTR-RT)占175.77Mb,Ty3-gypsy是主要的LTR-RT类型(58.92 Mb),其次是Ty1-copia(36.68 Mb)。JSU-FSP基因组的BUSCO和CEGMA完整性评估结果分别为97.83%和98.91%,表明基因组组装的完整性高。比较基因组分析结果表明,茉莉花谱系大约在5,400—5,700万年前从其他4种已知木樨科植物的祖先中分化出来。与其他4种木樨科植物的基因家族相比,JSU-FSP扩张基因显著富集于光合作用及萜烯骨架合成途径,这可能是赋予茉莉花喜光特性及含有丰富VTs的遗传基础。基因复制事件分析结果提示在JSU-FSP与其他木樨科植物分化之前,JSU-FSP发生了一次古老的全基因组复制事件,且JSU-FSP一半以上的旁系同源基因来自散在复制(51%),其次是来自全基因组复制(16%)、串联复制(10%的基因)和近端复制(7%),表明多样性的复制模式可能对茉莉花的遗传进化起到重要贡献。基于组装的参考基因组,鉴定到107个茉莉花萜类挥发物(VTs)、83个苯丙烷/苯环类挥发物(VPBs)、28个脂肪酸衍生挥发物(FADVs)、14个邻氨基苯甲酸甲酯和吲哚代谢途径相关结构基因以及81个β-葡萄糖苷酶(BGLU)基因家族成员,为进一步解析茉莉花香气合成调控机制提供重要基础。(2)建立不同发育时期茉莉花香气合成的转录调控网络。采集S1(花芽期)、S2(露瓣期)、S3(成熟期)、S4(初开期)以及S5(末花期)5个时期的茉莉花样品,利用基于顶空固相微萃取(HS-SPME)结合气相色谱-质谱(GC-MS)的广泛靶向挥发物组(WTV)技术对挥发性有机化合物(VOCs)进行检测。结果表明茉莉花大部分香气组分在花初开期大量合成。结合香气活度值(OAV)分析鉴定到20个茉莉花关键香气组分,包括VTs化合物α-法呢烯、芳樟醇、香叶醇、3-蒈烯、橙花叔醇和β-月桂烯;VPBs化合物乙酸苄酯、苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸、苯乙醛、水杨酸甲酯、2-(甲氨基)苯甲酸甲酯和苯甲酸苄酯;FADVs化合物3-己烯-1-醇苯甲酸酯、(Z)-3-己烯-1-醇乙酸酯、顺-3-己烯基己酸酯和(E)-2-己烯醛;邻氨基苯甲酸甲酯和吲哚。联合转录组学与实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)技术分析发现,有47个参与VTs、VPBs及FADVs合成的结构基因是赋予茉莉花花香气合成的重要候选基因。进一步通过K-means聚类及权重基因共表达网络分析(WGCNA)鉴定到12个转录因子基因,包括4个MYB＿related、2个HB-other、1个DBB、1个C3H、1个C2H2、1个Trihelix、1个NAC和1个SBP家族成员可能为参与茉莉花香气合成的枢纽基因。(3)采后茉莉花开放过程中香气合成的转录调控分析。模拟茉莉花茶加工过程中的实际条件对成熟茉莉花苞进行采样,包括F1(成熟未开放花苞,采样时间为17:00 p.m.)、F2(花开放至“碗状”)、F3(花朵完全开放)、F4(花朵开始衰败)和F5(花瓣严重失水)5个阶段花朵样品。挥发物代谢组分析结果表明大部分香气VOCs在F2时期含量最高。其中,有16种挥发物被认为是采后茉莉花中的关键香气组分。芳樟醇、α-法尼烯、d-橙花叔醇、香叶醇、α-杜松烯、苯甲醇、苯甲醛、乙酸苄酯、苯甲酸甲酯、3-己烯-1-醇苯甲酸酯和(Z)-3-己烯-1醇乙酸对茉莉花香味起决定作用,而苯乙醛、苯甲酸甲酯、2-(甲氨基)苯甲酸甲酯和(E)-2-己烯醛对茉莉香气起修饰作用。整合多倍通量全长转录组与二代转录组测序分析,将数据比对至JSU-FSP参考基因组后,获得精确的转录本数据。联合香气组分分析发现关键香气组分变化趋势与相关结构基因及10个Js BGLU基因表达水平显著正相关,表明采后茉莉花香气合成可能同时来源于从头合成与糖苷结合挥发物的水解。通过WGCNA分析发现,大量热激蛋白(Heat Shock Protein,HSP)基因表达水平与关键香气组分合成规律高度正相关,且为共表达模块中的枢纽基因,可能参与维持采后茉莉花开放过程中的正常释香。(4)Js LHY转录因子调控茉莉花香气合成。第三章与第四章的香气组分测定联合转录组分析结果均表明,MYB＿related(Jsa09G011050.1)转录因子被注释为生物钟相关基因,其作为枢纽基因无论是在不同发育阶段的花器官还是采后茉莉花开放过程中的表达量变化趋势均与茉莉花关键香气组分合成规律极显著正相关。通过多序列比对和进化树分析,确定该基因为生物钟核心元件LATE ELONGATED HYPOCOTYL(LHY)。亚细胞定位分析结果表明该基因定位于细胞核,通过酵母自激活验证实验表明该基因具有转录激活活性。利用DNA亲和纯化测序法(DAP-seq)、双荧光素酶报告和酵母单杂交实验,证明了Js LHY能与6个香气合成相关结构基因(Js BEAT1、Js TPS34、Js CNL6、Js BPBT、Js AAAT5和Js4CL7)的启动子区域结合,并直接促进它们的表达。此外,利用反义寡核苷酸(As ODN)技术处理可显著抑制Js LHY在茉莉花开放时期的表达,同时Js LHY结合基因的表达量也显著下降。相应地,α-法尼烯、乙酸苄酯、苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸、苯乙醛、水杨酸甲酯、2-(甲氨基)苯甲酸酯以及苯甲酸甲酯这9个茉莉花关键香气组分含量也显著降低。这些结果表明,茉莉花中的LHY为香气合成的正调控因子,对茉莉花香气合成至关重要。这也为高效利用茉莉花香气组分发掘鉴定到潜在的调控靶点。(5)茉莉花发育过程中花色素代谢的转录调控机制与Jsa-miR156w的功能表征。以S1、S2、S3、S4及S5时期的茉莉花样品为材料,通过对花色表征与代谢组分测定发现成熟期茉莉花瓣中叶绿素含量的减少,香豆素、肉桂酸和苯乙酸等白色物质含量的增加和柚皮素、槲皮素、槲皮苷、山奈酚、黄酮、圣草酚、芦丁等黄色类黄酮化合物含量的减少导致茉莉花的颜色从初期的黄绿色变为白色。结合转录组分析表明,叶绿素含量的减少主要是叶绿素合成相关基因表达量减少和叶绿素降解相关基因表达量增加共同作用的结果。同时,类黄酮合成通路中的关键限速酶基因Js CHIs在茉莉花开放阶段的表达下降是导致类黄酮含量下降的主要原因。末花期类黄酮合成相关基因表达上调导致类黄酮含量上升是导致茉莉花瓣重新转黄的原因。此外,通过s RNA-seq分析发现了Jsa-miR156w,在白色茉莉花(即成熟花)中特异表达。裂解位点验证与GUS报告实验分析表明,Jsa-miR156w可裂解转录因子基因Js SPL8和Js SPL17从而负调控其表达。Js SPL8和Js SPL17是片段复制基因,其编码的蛋白定位于细胞核,具有转录激活活性。酵母单杂交实验结果表明,它们都能与叶绿素合成基因Js Hem C、Js Hem L和Js DVR以及与类黄酮生物合成有关的Js CHI的启动子结合,并促进它们的表达。这些发现为了解茉莉花开花期的颜色变化提供了新的视角,并揭示了miR156-SPLs协调茉莉花叶绿素和类黄酮化合物代谢的分子机制。以上结果为茉莉花香与花色性状改良提供理论依据,同时为将来进一步深入开展分子遗传学研究,高效调控茉莉花开花时间、花香及花色等众多性状的基因进行功能验证提供了重要的遗传信息资源。

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