梅花花朵抗寒性评价及响应低温胁迫关键WRKY基因筛选
梅花花朵抗寒性评价及响应低温胁迫关键WRKY基因筛选
梅花(Prunus mume)是中国十大传统名花,在中国有3 000多年栽培历史,深受大家喜爱。低温是影响梅花栽培应用的重要环境因素,抗寒育种一直是梅花育种的重要方向。在江南地区,早春的低温(低于-3℃)会对花朵造成严重冻害,从而极大地影响观赏价值。WRKYs是一类主要存在于植物中的转录因子,参与响应非生物胁迫等过程。本研究通过低温处理‘江梅’(Prunus mume‘Jiangmei’)、‘红颜朱砂’(Prunus mume‘Hongyan Zhusha’)、‘宫粉’(Prunus mume‘Gong Fen’)、‘玉蝶9222’(Prunus mume‘Yudie 9222’)、‘素玉绿萼’(Prunus mume‘Suyu Lve’)、‘送春’(Prunus mume‘Songchun’)、‘美人’梅(Prunus mume‘Meiren’)7个梅花品种的小蕾期、大蕾期、初开期、盛开期的花瓣,测定低温胁迫后内在的生理生化变化,评价不同品种花朵的抗寒性;同时对梅花全基因组进行WRKYs家族的鉴定与分析,筛选出响应低温的关键WRKY基因,并鉴定其功能。本研究主要结果如下:1.不同梅花品种抗寒性评价:通过不同低温处理,测定并统计过冷却点、褐变率、相对电导率及生理生化指标的含量。过冷却点结果显示不同花期的抗寒性由强到弱为小蕾期大蕾期初开期盛开期;利用隶属函数值对7个品种梅花花瓣抗寒性进行综合评价,由强到弱的顺序为‘送春’‘美人’梅‘玉蝶9222’‘素玉绿萼’‘宫粉’‘江梅’‘红颜朱砂’。2.梅花中WRKYs基因家族分析:利用生物信息学方法对梅花WRKY基因家族进行分析并通过实时荧光定量PCR筛选应答低温的基因。筛选出58个含有WRKY结构域的WRKYs转录因子;共定位在8条染色体上,其中PmWRKY33-2未定位到任何一条染色体上;以拟南芥(Arabidopsis thaliana)的At WRKYs作为分类标准,分为3组,5个亚族,而PmWRKY30不能归类;低温处理后,34个PmWRKYs表达上调,21个PmWRKYs表达下调,4个PmWRKYs不规律表达;其中PmWRKY57的表达量最高,说明PmWRKY57可能参与低温胁迫。3.PmWRKY57的功能鉴定:分离候选基因PmWRKY57,ORF长度为993 bp,编码氨基酸330 aa,属于Group IIc,低温与ABA处理后表达量发生变化。亚细胞定位结果显示PmWRKY57定位在细胞核内,转录激活实验验证PmWRKY57N端具有转录激活活性;用超表达载体p ORE＿R4-PmWRKY57遗传转化拟南芥,低温处理后转基因拟南芥表型表现为较强的耐寒性;苗期幼苗经受低温或ABA胁迫后,发现转基因植株在低温胁迫条件下根长比对照植株相对较长,而在ABA胁迫下根长受到抑制但侧根数量增加;测定生理指标发现:转基因拟南芥植株的SOD、POD、脯氨酸的含量高于野生型WT,而MDA、H_2O_2、O~(2-)含量相较于野生型低,说明超表达PmWRKY57的拟南芥植株表现为更强的耐寒力。
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