长春花CrZCTs转录因子调控文多灵及长春质碱合成研究
长春花Cathranthus roseus (L.) G. Don是夹竹桃科长春花属中研究最为广泛的药用和观赏植物之一[1-3]。长春花中能够合成150多种萜类吲哚生物碱（terpenoid indole alkaloids，TIAs），包括有效的抗肿瘤成分文多灵和长春质碱等[4-6]，由于TIAs及其衍生物具有重要的药理特性得已在临床上广泛应用，全球的需求也正在不断增加[7-9]。然而与大多数药用植物中次生代谢物积累情况相类似，文多灵和长春质碱等TIAs在天然植物中含量极低，使得它们的生物提取受到限制，远远无法满足临床需求，因此如何提高它们在长春花中的含量一直备受广大科研工作者们关注[10-12]。
由于TIAs化学结构复杂，其化学合成或半合成的方法因程序复杂、较难控制和成本高等问题，致使它们目前还无法替代天然植物提取，进而无法实现在临床治疗中的应用[13-15]。此外，研究者们试图通过次生代谢工程等手段提高它们在细胞内的合成效率，包括在悬浮细胞及毛状根的培养过程中添加诱导子、前体化合物、以及植物激素等方法，然而这些方法的应用均具有一定的局限性，如生产成本偏高等，同时也未能有效地大幅度提高TIAs的积累，尚不具有商业前景[16-19]。
植物中含有众多的转录因子，已经有越来越多的转录因子被研究学者发现可以用以调控植物的次生代谢[20-22]，其主要的调控方法就是和植物次生代谢产物相关的酶基因的启动子结合，促进或抑制酶基因的表达，进而影响次级代谢产物的合成效率[23-25]。近年来，对长春花TIAs合成途径的代谢调控研究已经取得很大进展，多个限速酶基因已经成功被克隆并进行功能鉴定[26-27]。然而，长春花TIAs的合成不仅是一个复杂的合成过程，而且调控也非常复杂，受多种因素协同调节的，其中转录因子是核心的调节因子，起关键作用，想要阐明调控机制及合成过程，还需要对TIAs的转录因子进行深入研究[6,28]，长春花的转录因子包括增强（ORCA2、ORCA3、BIS1、BPF1、MYC1、MYC2、WRKY等）和抑制转录因子（JAZ、ZCTs、GBF1、GBF2等）[26-27]，其中，长春花CrZCTs（zinc finger Catharanthus tranion factor）属于Cyst/His2-type锌指蛋白家族，它包含3个成员CrZCT1、CrZCT2和CrZCT3。研究表明，CrZCTs均能特异性结合到TIAs合成关键酶基因CrSTR和CrTDC的启动子上，并抑制二者的表达，是长春花TIAs合成的一个负调控因子[31-34]。序列分析表明CrZCTs基因家族的结构域中存在1个EAR（Ethylene-responsive element binding factor- associated amphiphilic repression）抑制基因序列，这可能是抑制TIAs生物合成的主要原因[35]。CrZCTs的功能可以抵消CrORCA2、CrORCA3对CrSTR和CrTDC的激活作用[34,36]。然而目前对CrZCTs转录因子之间的关系、功能和调控机制的了解却仍然有限[30,34]。
本研究主要通过VIGS技术，采用不同的基因沉默组合方式，分析TIAs合成途径关键酶基因和CrZCTs的相对表达量变化，检测文多灵和长春质碱积累量的变化，研究CrZCTs调控TIAs合成的功能差异和机制，为有效调控TIAs合成提供必要的理论依据及基因元件。
1 材料
样品由大连工业大学于放教授鉴定为健康的长春花C. roseus (L.) G. Don种子，于本实验室保存。使用75%乙醇表面灭菌1 min，再使用10% NaClO2再灭菌10 min。然后用无菌蒸馏水冲洗种子10次，置于MS基础培养基上发芽。种子在16 h光照和8 h黑暗周期下生长，保持温度（25±2）℃。发芽4周后，将具有2～3对真叶的幼苗移植到土壤中，并在温度25 ℃光照15 h条件下生长。
对照品文多灵（批号A212A024）和长春质碱（批号0424A022）均购自北京索莱宝科技有限公司，质量分数均≥98%。
2 方法
2.1RNA提取及载体构建
使用TRIzol试剂提取长春花叶片总RNA，使用M-MLV反转录酶合成cDNA。以cDNA为模板，使用特异性引物（表1），巢式PCR扩增目的片段CrZCT1（296 bp）、CrZCT2（327 bp）和CrZCT3（408 bp）。PCR产物回收纯化后与pGM-T载体连接，构建克隆载体pGMT-CrZCT1、pGMT-CrZCT2和pGMT-CrZCT3，并测序验证。
将验证正确的pGMT-CrZCT1、pGMT-CrZCT2和pGMT-CrZCT3分别用XbaI/BamH I、Sac I/BamH I和SacI/Xho I双酶切。将酶切下的目的基因片段CrZCT1、CrZCT2和CrZCT3的cDNA分别与pTRV2载体（本实验保存）连接，构建单基因沉默载体pTRV2-CrZCT1、pTRV2-CrZCT2和pTRV2- CrZCT3。将载体pTRV2-CrZCT1、pTRV2-CrZCT2和pTRV2-CrZCT3分别用SacI/BamH I、Sac I/Xho I和XbaI/BamH I双酶切，并与上述的酶切后的CrZCT2、CrZCT3和CrZCT1片段连接，分别构建双基因沉默载体pTRV2-CrZCT1-2、pTRV2- CrZCT1-3和pTRV2-CrZCT2-3。使用XhoI/BamH I双酶切载体pTRV2-CrZCT1，并与CrZCT2、CrZCT3片段连接构建3基因沉默载体pTRV2-CrZCT1-2-3。本实验所用试剂和pGM-T载体均来自天根生化科技有限公司，所用酶均来自宝生物工程有限公司。
2.2病毒诱导的基因沉默
将根瘤农杆菌GV3101（本实验室保存）在含有25 μg/mL利福平和50 μg/mL庆大霉素的溶菌肉汤（LB）固体培养基上28 ℃培养48 h。挑取单菌落于含有25 μg/mL利福平和50 μg/mL庆大霉素的50 mL LB液体培养基中，在28 ℃摇床180 r/min下过夜培养，直至A600＝0.8。制备农杆菌感受态并将质粒pTRV2-CrZCT1、pTRV2-CrZCT2、pTRV2-CrZCT3、pTRV2-CrZCT1-2、pTRV2- CrZCT1-3、pTRV2- CrZCT2-3、pTRV2-CrZCT1-2-3、pTRV2（对照CK）、pTRV2-PDS（八氢番茄红素脱氢酶基因，表型对照）分别转化到GV3101中。将转化成功的GV3101在含有10 mmol/L 4-吗啉乙磺酸（MES），20 μmol/L乙酰丁香酮和50 μg/mL卡那霉素的100 mL LB培养基中培养过夜，温度为28 ℃，摇床转速为180 r/min。在4 500 r/min下离心10 min收集细菌，并使用5 mL侵染缓冲液（10 mmol/L MgCl2、20 mmol/L MES和200 μmol/L乙酰丁香酮）重悬菌体，在28 ℃摇床中180 r/min共培养3 h。将含有pTRV1的菌株悬浮液与分别含上述9种质粒菌株等体积混合，轻弹混匀，再将9种混合菌液分别通过注射器注入长春花幼苗的顶端分生组织中。侵染后将植物在25 ℃光照16 h条件下大约生长4周，并观察PDS表型，当产生可见的光漂白症状时（图1），分别选取和收集与白色叶片相对应位置的不同处理的叶片作试验样品。
2.3实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析
提取样品叶片的总RNA，并进行反转录cDNA，采用qRT-PCR分析长春花叶片中CrZCTs和TIA合成途径关键酶基因的表达水平，为了确保结果的准确性，引物设计均保证了扩增序列的唯一性，各引物见表1。实时定量荧光PCR仪为LightCycler 480（罗氏公司，上海），扩增条件：95 ℃、5 min；95 ℃、20 s；50 ℃、20 s；72 ℃、20 s循环40次；40～70 ℃10 min。将得到的Ct值使用2−ΔΔCt方法计算，计算得到相关的Ct值，每个基因重复3次实验，并计算相关均值及误差，使用均值和误差进行分析。
2.4生物碱提取及分析
样品称量鲜质量后，将其在液氮中冷冻并研磨成粉末，在室温下用甲醇萃取1 h，取提取液上清真空干燥，然后重新溶解在甲醇中，重复萃取3次。用0.22 μm的滤膜滤过样品，使用沃特世HPLC系统（Alliance 2690）分析长春花叶片中的长春质碱及文多灵含量。色谱柱为反相C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相分别为50 mmol/L磷酸盐缓冲液-甲醇（20∶80），等度洗脱，保留时间1 h，检测波长分别为长春质碱280 nm，文多灵310 nm；体积流量1 mL/min，进样量为10 μL，柱温为30 ℃。文多灵和长春质碱对照品制作标准曲线[37]，文多灵的标准曲线方程为Y＝0.692 0 X－5.438，R2＝0.999 9；长春质碱的标准曲线方程为Y＝0.864 5 X－14.18，R2＝0.999。方法学考察参考文献方法[37]，精密度、重复性、稳定性、加样回收率均符合要求。
2.5数据处理与分析
所有实验进行3次重复，通过Microsoft Excel 2019软件对数据进行计算和整理，采用SPSS软件对数据进行方差分析和最小显著差异性检验，通过GraphPad Prism进行图表绘制。
3 结果与分析
3.1pTRV2-CrZCTs载体的构建
在3种CrZCTs基因片段两端设计带有不同限制性内切酶的酶切位点的特异引物，然后以野生长春花cDNA为模版，进行巢式PCR扩增，分别得到CrZCT1、CrZCT2、CrZCT3基因沉默片段（图2-A）。并成功构建了7种不同组合的CrZCTs沉默载体，其双酶切验证结果如图2-B所示，各酶切片段长度均符合相应目的基因长度。
3.2不同沉默组合方式下CrZCTs相对表达量变化
分析了7种不同组合（3种单个、3种任意2个组合和1种3个CrZCTs的沉默）下的3种CrZCTs的相对表达量，如图3所示，当成功沉默其中某一个CrZCT1、CrZCT2或CrZCT3（分别依次为空白对照的14.78%、11.99%和7.37%）时，相应未处理的2个转录因子表达量也随之显著下调（分别仅为对照的12.77%～47.22%），此外，当仅沉默CrZCT1或CrZCT2时，CrZCT3（40.72%或47.22%）的相对表达量比CrZCT2（18.86%）或CrZCT1（21.42%）高1.15倍和1.20倍；当仅沉默CrZCT3时，CrZCT1（26.96%）和CrZCT2（22.77%）的相对表达量相近。
类似的当同时沉默任意2个CrZCTs时，未处理的基因表达量也显著下调，且当沉默CrZCT1-2时，CrZCT3较CrZCT1和CrZCT2的相对表达量高，当CrZCT1-3或CrZCT2-3沉默时，CrZCT2或CrZCT1的相对表达量相似，且均是该组合下的最高。沉默CrZCT1-2-3时，3种转录因子的表达水平均下调。结果表现出三者间随沉默基因下调表达而下调的一致性，但下调幅度不一致，三者中CrZCT1和CrZCT2有相似的下调表达趋势。
3.3TIA合成途径中关键酶基因表达量分析
为明确CrZCTs对TIAs合成途径的不同影响，分析了7种不同沉默组合处理下5个关键酶基因（CrTDC、CrSTR、CrG10H、CrT16H和CrDAT）的相对表达水平。从图4可看出与对照组pTRV2（CK）相比，7种处理下均使得CrTDC的表达水平显著上升，分别依次升高了1.76、1.91、2.12、2.61、3.00、3.32、7.69倍，且表现为同时沉默3个CrZCTs的促进效果大于任意2个的组合大于1个，且单独沉默CrZCT1或CrZCT2的促进CrTDC上调间差异不显著，但且均显著小于CrZCT3的促进作用；沉默CrZCT1-3和CrZCT2-3的作用大于CrZCT1-2，呈现出CrZCT1和CrZCT2相似的促进作用。其余4个基因CrSTR、CrG10H、CrT16H和CrDAT的相对表达量也均显著上调，变化范围分别为1.43～14.65倍、1.56～10.73倍、1.99～9.16倍和1.87～12.04倍，且CrZCTs的作用方式和表达趋势均与前述的CrTDC类似或完全一致，在此不再详细分析。
3.4文多灵和长春质碱含量的分析
为研究CrZCTs对TIAs生物合成的影响，使用HPLC检测不同沉默组合处理下叶片中文多灵和长春质碱的积累情况。如图5所示，与pTRV2对照相比，7种不同处理下，文多灵的积累量分别显著增加了15.27%、21.37%、42.74%、51.91%、64.12%、56.48% 和128.24%。而长春质碱积累量也分别显著增加了12.24%、11.56%、18.36%、22.31%、26.53%、32.65%和96.35%。结果表明不同处理组合均可以促进文多灵和长春质碱的积累，但促进效果不同，且表现出与促进关键酶基因表达类似的趋势。
结合前述实验表明，3个转录因子CrZCTs间相互协调，共同调控着酶基因的表达和生物碱的积累，且CrZCT1和CrZCT2的作用和影响相似，而rZCT3调控能力较CrZCT1和CrZCT2更强，起主要的调控作用。
4 讨论
Li等[38]应用RNAi技术，发现在转基因CrZCT-RNAi（单个）毛状根中均降低了其余CrZCTs基因的转录水平，而在本研究中应用VIGS技术沉默1个或2个均会相应的降低未沉默处理的转录因子的表达水平，均表明3个不同的CrZCTs间存在直接或间接的相互作用和调控，但具体的作用机制还需更深入的研究。
本课题组此前已成功克隆到3个转录因子的全长cDNA[39]，对CrZCTs进行分析表明分别由178（相对分子质量19 600）、190（相对分子质量21000）、259（相对分子质量27 400）个氨基酸组成，序列表明CrZCT1和CrZCT22个转录因子的大小和结构域等更相似，它们的功能应该更相近，而CrZCT3的2个锌指之间的间隔区比CrZCT1和CrZCT2的间隔区长，表明它与CrZCT1和CrZCT2相比具有结合不同靶DNA序列的能力[31]。本研究结果也表明CrZCT1和CrZCT2的调控的作用相似，而CrZCT3促进和调控TIAs能力更大。这说明锌指家族的转录因子在长春花中当其结构域中2个锌指结构之间的间隔区较长时，该转录因子的调控能力可能更明显。此外，Chebbi等[40]也证明CrZCT1和CrZCT2而不是CrZCT3抑制CrHDS启动子活性，CrZCT3的表达水平高于CrZCT1和CrZCT2，调控更强。Pauw等[31]研究发现3种CrZCTs蛋白在抑制CrSTR和CrTDC表达方面似乎功能等效，认为它们在功能上是冗余的，但每个CrZCTs蛋白也具有特定功能的可能性。Verma等[35]研究也表明所有三种CrZCTs转录因子中，CrZCT3是提高萜类吲哚生物碱产量的主要调控因素。在成熟的叶片中CrZCT3表达量最高，约为CrZCT1和CrZCT2的2倍，生物碱积累量反而大幅度下降[41]。本研究也表明，单独沉默CrZCT3比单独沉默CrZCT1和CrZCT2对TIAs的积累更有效，同时沉默3个转录因子后TIAs的积累会更高，这也进一步证明了锌指家族的转录因子在调控长春花中的TIAs时CrZCT3为主要负调控因素，CrZCT1和CrZCT2为辅助调控因素。Li等[29]研究也认为CrZCTs阻遏物在长春花中发挥重叠冗余但不同的功能。本研究和大量前述的研究均表明CrZCTs三者由于它们间的高度同源性，有着相似的功能，相互协调，通过与其他调控因子和关键酶基因相互作用，参与TIAs代谢网络的调控，影响TIAs的合成和积累，但三者间的调控能力各不相同，CrZCT3能力更强[31,38-41]。因此推测长春花其他转录家族中具有高度同源性的转录因子可能也存在相似的功能，其中一个作为主要的调控因子，其余作为次要调控因素或作为主要调控因子的辅助因子，相互协调参与到长春花次生代谢网络的调控中。
长春花作为重要的药用植物之一，能够合成大量的治疗癌症的天然药物成分的TIAs，然而这些天然产物含量极低，需要通过各种手段和方法促进其含量，增加产量，以更好地保护人类的生命健康。本研究基本明确了转录因子CrZCTs之间的关系和功能，为有效地调控长春花TIAs生物合成提供了必要的理论依据和基因元件。因此在长春花的栽培和生产上，由于序列的同源性和功能上的冗余性，当仅沉默某1个CrZCTs时，不足以有效的促进TIAs含量，只有当同时沉默3种CrZCTs时可以更好地减轻它们对生物碱生物合成的抑制，有效地促进TIAs含量，增加TIAs的总产量以满足不断成长的TIAs市场需求。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：张燕妮，崔 悦，刘 师，李芙蓉，孙小涵，于 放，刘志文．长春花CrZCTs转录因子调控文多灵及长春质碱合成研究 [J]. 中草药, 2024, 55(18): 6335-6343.
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