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一种除虫菊酯类杀虫剂降解菌株及其菌剂和降解工艺的制作方法

花匠小妙招
2024-09-28 05:20

本发明属于微生物降解技术领域。更具体地，涉及一种除虫菊酯类杀虫剂降解菌株及其菌剂和降解工艺。

背景技术：

拟除虫菊酯类杀虫剂是一类模拟天然除虫菊酯的化学结构合成的农药，具有杀虫谱广、高效、低毒、低残留的特点，在农业上得到了广泛的应用，经常被用于防治果树和蔬菜的食叶及食果害虫。此外，其在家用杀虫方面也得到了广泛的应用，如对蚊虫、牲畜寄生虫以及蟑螂的防治具有显著的效果，其使用量在国际农药市场中位居第二位，且仍在持续增长。其中，丙烯菊酯是1949年由美国人miltons.schechter合成的第一个商品化拟除虫菊酯农药，被广泛应用于防治茶树、蔬菜、果树、棉花、花卉、林木及家庭卫生害虫。

然而，近年来随着拟除虫菊酯类杀虫剂的广泛及不合理使用，其对生态环境和人类健康带来的危害也越来越受到关注。目前，已有研究表明，拟除虫菊酯类杀虫剂通过钠离子通道干扰非靶标水生生物的神经传导功能，其对鱼类的毒性比哺乳动物和鸟类高1000倍；龙虾、青虾、河蟹等甲壳类生物对拟除虫菊酯类杀虫剂相当敏感，严重威胁水生生态系统的稳定性及其食物链的多样性(zhanhetal,kineticsandnoveldegradationpathwayofpermethrininacinetobacterbaumanniizh-14[j],frontiersinmicrobiology,2018,9:98)。另一方面，拟除虫菊酯类杀虫剂通过食物链的方式生物富集最终摄入人体，危害人类健康。人类暴露于此类杀虫剂可能会产生神经毒性、生殖毒性和免疫毒性，且有致癌的风险。同时，拟除虫菊酯类杀虫剂还具有拟雌激素作用，在体内与雌激素受体结合，干扰正常激素的合成、分泌及调节等过程。

丙烯菊酯一种i型拟除虫菊酯，已被广泛应用于防治茶树、蔬菜、果树、棉花、花卉、林木及卫生害虫，其大量使用造成的环境残留同样也严重威胁生态环境和人类健康。如通过剂量依赖性研究发现，丙烯菊酯可以抑制角膜上皮细胞的增殖，此外，它还会在哺乳动物中引起免疫遗传毒性，也可以改变了人类浆细胞的生化特性(nahgetal,allethrinandprallethrinstimulatesmuc5acexpressionthroughoxidativestressinhumanairwayepithelialcells[j],biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2018,503:316-322)。急性和慢性暴露于丙烯菊酯会危害血液，神经，脂肪等组织。综上，丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的环境残留已成为威胁生态环境和人类健康的一大社会问题，因此，环境中拟除虫菊酯类杀虫剂残留的去除具有重大的生态、社会和经济效益。同时，如何环保地解决拟除虫菊酯类杀虫剂在生态环境的残留问题，已成为环境科学探索的热点和重点。

微生物降解因其条件温和、无二次污染和优异的代谢活性，成为拟除虫菊酯类杀虫剂残留修复的主流技术。现有已报道的丙烯菊酯降解微生物包括巨大芽孢杆菌(bacillusmegalosporus)菌株hlj7(cn111004736a)、鞘氨醇单胞菌(sphingomonastrueperi)菌株cw3、琥珀葡萄球菌(staphylococcussuccinus)菌株hlj-10、非脱羧勒克菌(leclerciaadecarboxylata)菌株y4、产碱菌属(alcaligenessp.)的菌株a-6；但是，由于降解微生物自身的遗传特性及代谢活性不同，导致其降解拟除虫菊酯类杀虫剂的效率也不同。因此，这为筛选高效降解拟除虫菊酯类杀虫剂的微生物提出了新的难题，也成为微生物降解拟除虫菊酯类杀虫剂的研究热点。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂残留降解修复技术的缺陷和不足，提供一种除虫菊酯类杀虫剂降解菌株及其菌剂和降解工艺。本发明提供了一株降解丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的菌株及其生产的降解菌剂和降解工艺条件，可用于快速高效降解拟除虫菊酯类杀虫剂，修复被拟除虫菊酯类杀虫剂残留污染的土壤和水体等环境。

本发明的目的是提供一株硝基还原假单胞菌(pseudomonasnitroreducens)cw-7。

本发明另一目的是提供硝基还原假单胞菌在降解拟除虫菊酯类杀虫剂或制备拟除虫菊酯类杀虫剂降解菌剂中的应用。

本发明另一目的是提供硝基还原假单胞菌在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境中的应用。

本发明另一目的是提供一种拟除虫菊酯类杀虫剂降解菌剂。

本发明再一目的是提供一种修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一株硝基还原假单胞菌(pseudomonasnitroreducens)cw-7，该菌株已于2020年6月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmccno：61063，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明首次发现了硝基还原假单胞菌(pseudomonasnitroreducens)对丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的降解作用，并筛选得到一株高效快速降解丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的硝基还原假单胞菌(pseudomonasnitroreducens)cw-7，该菌株是从广西南宁某农药厂废水处理池的活性污泥中经人工富集培养、分离纯化得到，对丙烯菊酯具有高效快速的降解效能，在以丙烯菊酯为唯一碳源的基础盐培养基中培养7天，对50mg·l-1丙烯菊酯的降解率达到96％，可耐受800mg·l-1高浓度丙烯菊酯，并对其他拟除虫菊酯杀虫剂(如苯氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯、高效氯氰菊酯、氯烯炔菊酯或联苯菊酯)也同样具有降解效果；将该菌株接种污染土壤7天后，土壤中丙烯菊酯残留量(50mg·l-1)降低95％，降解能力优异，可高效快速去除水体和土壤中该类农药残留量，可以作为优良的生物降解菌应用于丙烯菊酯污染位点的生物修复。

因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

硝基还原假单胞菌在降解拟除虫菊酯类杀虫剂或制备拟除虫菊酯类杀虫剂降解菌剂中的应用。

硝基还原假单胞菌在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境中的应用。

优选地，所述硝基还原假单胞菌为所述硝基还原假单胞菌cw-7。

优选地，所述拟除虫菊酯类杀虫剂为丙烯菊酯、苯氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯、高效氯氰菊酯、氯烯炔菊酯或联苯菊酯中的任意一种或几种。

优选地，所述自然环境为水体或土壤。

本发明还提供了一种拟除虫菊酯类杀虫剂降解菌剂，含有硝基还原假单胞菌和/或其菌悬液。

优选地，所述硝基还原假单胞菌为所述硝基还原假单胞菌cw-7。

本发明还提供了一种修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境的方法，用所述降解菌剂处理自然环境，稀释后的降解菌剂中菌体数量为1.0×105～1.0×109cfu/ml。

优选地，稀释后的降解菌剂中菌体数量为1.0×106cfu/ml。

优选地，降解工艺条件为：降解温度为25～35℃，ph为6.0～8.0，拟除虫菊酯类杀虫剂初始浓度为50～150mg/l或50～150mg/kg。

更优选地，降解工艺条件为：降解温度为32℃，ph为7.0，拟除虫菊酯类杀虫剂初始浓度为150mg/l或150mg/kg。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次公开了硝基还原假单胞菌(pseudomonasnitroreducens)对丙烯菊酯、苯氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯、高效氯氰菊酯、氯烯炔菊酯、联苯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的降解作用，并筛选得到了一株高效快速降解丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的硝基还原假单胞菌cw-7，该菌株可用于修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的水体、土壤等自然环境，直接施用7天后可使水体和土壤中拟除虫菊酯类杀虫剂残留量降低95％以上。

本发明提供的硝基还原假单胞菌cw-7丰富了农药降解菌的种质资源库，在拟除虫菊酯类杀虫剂残留污染的水体和土壤生物修复中有重大应用价值，为打破现有治理农药残留污染瓶颈提供了新的开发途径。

本发明进一步提供了一种拟除虫菊酯类杀虫剂降解菌剂以及该菌剂最优降解工艺条件，即采用响应曲面法box-behnken设计获得，最优降解工艺条件为：降解温度为32℃，ph为7.0，拟除虫菊酯类杀虫剂初始浓度为150mg/l或150mg/kg，在此工艺条件下降解菌剂的降解效果明显提高，具有非常重要的理论和应用价值。

附图说明

图1是菌株cw-7的扫描电镜图。

图2是菌株cw-7的16srrna系统进化分析结果。

图3是硝基还原假单胞菌cw-7降解菌剂降解丙烯菊酯的响应曲面图；其中，(a)图为ph和温度交互影响降解菌剂降解丙烯菊酯；(b)图为ph和接种量交互影响降解菌剂降解丙烯菊酯；(c)图为接种量和温度交互影响降解菌剂降解丙烯菊酯。

图4是硝基还原假单胞菌cw-7生长与降解丙烯菊酯的动态图。

图5是硝基还原假单胞菌cw-7对拟除虫菊酯类杀虫剂的降解效果。

图6是基于gc-ms的丙烯菊酯的微生物降解结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所述培养基配方如下：

基础盐培养基(msm，g/l)：(nh4)2so4，2.0；cacl2·2h2o，0.01；feso4·7h2o，0.001；na2hpo4·12h2o，1.5；mgso4·7h2o，0.2；kh2po4，1.5。

luria-bertani培养基(lb，g/l)：酵母提取物，5.0；蛋白胨，10.0；氯化钠，10.0。

种子培养基和发酵培养基的配方与lb培养基一致。

以上培养基以蒸馏水配成，ph7.2，于高压湿热灭菌锅121℃灭菌20分钟。固体培养基：每1l培养基加入15g琼脂粉。

实施例1硝基还原假单胞菌(pseudomonasnitroreducens)cw-7的分离与鉴定

1、丙烯菊酯降解菌株的筛选分离

采集广西南宁某农药厂废水处理池的活性污泥，称取5g活性污泥样品加入到50ml含有丙烯菊酯(50mg/l)的上述msm液体培养基中。经30℃，200r/min培养7d后，每次按10％的接种量，将农药质量浓度从50mg/l依次升至100mg/l、200mg/l、400mg/l、800mg/l连续富集培养。然后将转接4次的培养液梯度稀释涂布于含有400和800mg/l丙烯菊酯的msm固体平板上，30℃倒置培养2d。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落在lb固体培养基上多次划线纯化，随后使用高效液相色谱法(hplc)验证其降解效果。

最终，分离获得一株高效降解丙烯菊酯的菌株，编号为cw-7，并利用15％的甘油将该菌株保存于-80℃。该菌株cw-7可以利用丙烯菊酯作为唯一的碳源和能源生长，7天内对丙烯菊酯的降解率达到96.0％。

2、菌株cw-7的鉴定

(1)形态学鉴定：

将菌株cw-7接种于lb固体平板上30℃倒置培养2d，观察其菌落形态，分析菌株的生物学特性以及扫描电镜下的形态。

菌株cw-7在lb固体平板培养2d的菌落呈现半透明，边缘不规则，表面光滑。其主要生物学特性为：革兰氏阴性，好氧。菌株cw-7的扫描电镜图如图1所示，可以看出，扫描电镜下可以观察到该菌株细胞呈杆状。

(2)16srdna分子生物学鉴定：

提取菌株cw-7基因组dna为模板，采用16srdna细菌通用引物(27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'；1429r:5'-ggttaccttgttacgactt-3')进行pcr扩增，pcr产物委托金唯智(广州)生物科技有限公司进行测序。将菌株测得的16srdna序列在genbank数据库中利用blast进行比对分析，并选择同源性较高的相关序列利用clustal-w及mega-x软件构建系统进化树及分析进化关系。

菌株cw-7的16srrna系统进化分析结果如图2所示，可以看出，本发明分离纯化得到的菌株cw-7的16srdna序列与硝基还原假单胞菌(pseudomonasnitroreducens)jyq3同源性达99％，进化距离最近。该菌株的培养特征、扫描电镜观察特征也与硝基还原假单胞菌最为相似。因此，鉴定该菌株属于硝基还原假单胞菌。

基于上述鉴定结果，将该菌株命名为硝基还原假单胞菌(pseudomonasnitroreducens)cw-7，并于2020年6月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmccno：61063，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2硝基还原假单胞菌cw-7降解菌剂的制备

使用上述硝基还原假单胞菌cw-7制备降解菌剂的生产工艺流程为：斜面菌种-摇瓶种子液-种子罐培养-生产罐发酵-降解菌剂(剂型可为悬浮剂或粉剂)。具体方法如下：

(1)将硝基还原假单胞菌cw-7菌种在lb固体平板上活化，接种于lb试管斜面上备用。

(2)将硝基还原假单胞菌cw-7的试管种接种于含250mllb培养基的1000ml摇瓶中，30℃恒温振荡至对数期，获得的菌液接种于种子罐，种子罐中装有灭菌的种子培养基，装液量为70％。将培养好的摇瓶菌液按10％的接种量接种于装液量为70％的种子罐，无菌空气的通气量为0.8m3/min，搅拌速度为210rpm/min，培养至对数生长期备用。

(3)将到达对数期的种子液按照10％的接种量投入装有发酵培养基的生产发酵罐(装液量为70％)发酵培养。投料后的生产罐，在1.1kg/cm3的压力下、121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至30℃后，通无菌空气，通气量为0.8m3/min，搅拌速度为210r/min，培养温度控制为30℃，整个工艺培养流程时间为36小时，发酵结束后菌体数量≥1.0×109cfu/ml，发酵完成后，培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型，或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体剂型。

实施例3硝基还原假单胞菌cw-7降解菌剂的降解工艺条件

1、实验方法

将硝基还原假单胞菌cw-7进行单因素降解试验，通过依次改变影响生长和降解的因素，如温度、ph值、降解浓度、接种量、装液量、振荡速率等，测定硝基还原假单胞菌cw-7降解菌剂的降解率，确定影响硝基还原假单胞菌cw-7降解菌剂的降解率的关键因素。

利用sas9.0统计软件根据响应曲面法box-behnken设计原则进行试验设计(表1)，以关键因子ph值(a)、温度(b)和拟除虫菊酯类杀虫剂初始浓度(c)为自变量，以丙烯菊酯降解率为响应值(y1)，建立多元二次回归方程，根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应曲面图。最后对多元二次回归方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的极值点，即硝基还原假单胞菌cw-7降解菌剂的最优降解工艺条件。

2、实验结果

响应曲面box-behnken设计试验结果如表1所示，可以看出，在试验设计的条件下，硝基还原假单胞菌cw-7对丙烯菊酯的降解率高达71％～96％，进一步说明了降解工艺条件的优化对提高硝基还原假单胞菌cw-7对丙烯菊酯降解率的必要性。

表1响应曲面box-behnken设计试验结果

通过sas9.0统计软件分析，获得硝基还原假单胞菌cw-7降解丙烯菊酯的多元二次回归方程为：y1＝95.44+3.125a+1.25b+2.875c+2.25ab+3.00ac+0.25bc-8.97a2+11.22b2-8.47c2。

统计分析结果表明，ph值(a)、温度(b)和拟除虫菊酯类杀虫剂初始浓度(c)对菌株cw-7降解效果的一次效应均达到显著水平(p<0.05)；其二次效应x12、x22和x32对菌株cw-7降解效果也达到显著水平(p<0.05)。

硝基还原假单胞菌cw-7降解菌剂降解丙烯菊酯的响应曲面图如图3所示，其中，(a)图为ph和温度交互影响降解菌剂降解丙烯菊酯；(b)图为ph和拟除虫菊酯类杀虫剂初始浓度交互影响降解菌剂降解丙烯菊酯；(c)图为拟除虫菊酯类杀虫剂初始浓度和温度交互影响降解菌剂降解丙烯菊酯。硝基还原假单胞菌cw-7降解菌剂降解丙烯菊酯的多元二次回归方程拟合模型的方差分析结果如表2所示，通过解方程得到该模型的临界值，即降解菌剂的降解工艺条件为：降解温度为24℃～36℃，ph为4.0～9.0，拟除虫菊酯类杀虫剂初始浓度为50～250mg/l，最优降解工艺条件为：温度32℃，ph7.0和拟除虫菊酯类杀虫剂初始浓度为150mg/l。

表2硝基还原假单胞菌cw-7降解菌剂降解丙烯菊酯的多元二次回归方程拟合模型的方差分析结果

实施例4硝基还原假单胞菌cw-7对丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的降解效果实验

1、实验方法

(1)种子液制备：将纯化后的硝基还原假单胞菌cw-7接入含有5ml的lb液体培养基过夜活化培养至对数期，4000rpm离心后，菌体用无菌生理盐水(0.9％nacl)冲洗两次，所得菌体作为接种体。

(2)降解性能测定：将100mg/的菌体接种至50ml含有丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂(50mg/l)的msm培养液中，以不接菌作为对照，每组三个重复。在30℃，200rpm条件下恒温摇床培养7天，每1d取样一次，利用紫外-可见光分光光度计测定硝基还原假单胞菌cw-7的生长情况(od600)，并采用高效液相色谱仪(hplc)测定其对丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的降解情况。

(3)色谱条件：hplc型号：2690型(waters,usa)；色谱柱：c18反相柱(phenomenex,250nm×4.60mm,5μm)；流速：1ml/min；柱温：常温(30±1℃)；流动相：乙腈:水(v:v)＝65:35；流速：0.7ml/min；检测波长：250nm；进样量：20μl；运行时间：34min。在上述条件下，丙烯菊酯的保留时间为28min。

按照下式计算丙烯菊酯降解率：降解率(％)＝(1-a1/a0)×100；其中，a1为硝基还原假单胞菌cw-7处理后丙烯菊酯残留浓度，a0为处理前的丙烯菊酯初始浓度。

质量控制：采用外标法校正标准物质制作标准曲线。

2、实验结果

硝基还原假单胞菌cw-7生长与降解丙烯菊酯的动态图如图4所示，可以看出，硝基还原假单胞菌cw-7能高效降解丙烯菊酯，并可利用其作为生长的唯一碳源。且丙烯菊酯降解与硝基还原假单胞菌cw-7生长呈正相关。在丙烯菊酯作为唯一碳源条件下，硝基还原假单胞菌cw-7生长没有产生明显的滞后期，并迅速进入生长对数期，1～3天为菌株的生长对数期，此时该菌株对丙烯菊酯的降解最快；随着菌株生长达到稳定期，此时丙烯菊酯的降解曲线趋于平缓。培养4天后，菌株开始进入衰亡期。培养7天后，硝基还原假单胞菌cw-7对丙烯菊酯的降解率达到96.0％，而对照组(自然降解率)为9.4％。表明该硝基还原假单胞菌cw-7具有高效快速降解丙烯菊酯的能力。

硝基还原假单胞菌cw-7对拟除虫菊酯类杀虫剂的降解效果如图5所示，硝基还原假单胞菌cw-7降解拟除虫菊酯类杀虫剂的动力学参数如表3所示，图5和表3的结果揭示了丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的降解过程遵循一阶动力学模型，丙烯菊酯、苯氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯、高效氯氰菊酯、氯烯炔菊酯和联苯菊酯的降解常数(k)分别为0.4341、0.3413、0.1061、0.1995、0.1023、0.3609和0.2120，丙烯菊酯、苯氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯、高效氯氰菊酯、氯烯炔菊酯和联苯菊酯的理论半衰期(t1/2)值分别为1.59、2.03、6.53、3.47、6.77、1.92和3.26，降解系数(r2)分别为0.8877、0.9575、0.9738、0.9788、0.9829、0.8944和0.9994；表明实际降解数据与一阶动力学模型吻合良好，进一步说明了硝基还原假单胞菌cw-7具有高效降解拟除虫菊酯类杀虫剂的潜力。

表3硝基还原假单胞菌cw-7降解拟除虫菊酯类杀虫剂的动力学参数

注：k表示降解常数；r2是决定系数；t1/2是指理论半衰期(天)。

实施例5硝基还原假单胞菌cw-7对拟除虫菊酯类杀虫剂污染土壤的修复实验

1、供试土样

森林表层土(5～20cm)，取自广州市华南农业大学树木园，属红壤土，5年内没有施用丙烯菊酯和其他农药的记录。土壤的理化参数表征为(g/kg，干重)：有机物，10.5；总氮，0.5；总磷，0.4；总钾，18.2；ph值为6.9。土壤由65.0％沙子，28.0％淤泥和7.0％黏土组成。

土壤样品取回后首先置于阴凉通风处自然风干，风干后碾磨，过10目筛(2mm)，随后一部分土壤拿去121℃高温湿热灭菌1小时。分别取一定量的丙烯菊酯溶于丙酮中，然后浸泡硅藻土，使丙烯菊酯被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中风干，将其拌入灭菌和未灭菌的土壤中，使土壤中丙烯菊酯的终浓度为100mg/kg，然后置于30℃恒温恒湿培养箱中培养，按100mg/kg的接种量接入硝基还原假单胞菌cw-7，以加蒸馏水(即未加菌)的作为对照，土壤的持水量保持在40％左右。在30℃和避光条件下连续培养40天，并定期取样，hplc法测定丙烯菊酯残留量并计算降解率。降解率计算方法同以上实施例4。

2、实验结果

硝基还原假单胞菌cw-7在土壤中降解丙烯菊酯的动力学参数如表4所示，可以看出，丙烯菊酯降解过程遵循一阶动力学模型，其k值范围为0.0221至0.0459。丙烯菊酯降解的回归系数(0.9367～0.9514)表明降解数据与模型具有很好的相关性。在灭菌和未灭菌土壤中，丙烯菊酯降解的t1/2值分别为31.36天和15.10天。在未灭菌和灭菌土壤中加入100mg/kg硝基还原假单胞菌cw-7丙烯菊酯降解的t1/2值显着降低至6.23和11.38天。说明硝基还原假单胞菌cw-7在灭菌和未灭菌土壤中均显著提高了丙烯菊酯的降解率。

通过加入硝基还原假单胞菌cw-7，在未灭菌的土壤中观察到最大的丙烯菊酯降解效果，这可能是由于存在多种微生物群落所致。同样，与未加硝基还原假单胞菌cw-7的对照相比，在未灭菌土壤中也观察到良好的降解效果。在灭菌和未灭菌的土壤中，对照的t1/2分别为31.36和15.10天，而在用硝基还原假单胞菌cw-7处理的同一土壤中，t1/2分别显着降低至11.38和6.23天。说明硝基还原假单胞菌cw-7在土壤中也能发挥高效的降解潜力，可用于大规模污染土壤或地下水的处理。

表4硝基还原假单胞菌cw-7在土壤中降解丙烯菊酯的动力学参数

硝基还原假单胞菌cw-7降解菌剂在直接施入土壤中后，没有出现不降解或降解滞后效应现象，其降解性能稳定，为硝基还原假单胞菌cw-7对丙烯菊酯的土壤修复提供了科学依据。

实施例6硝基还原假单胞菌cw-7对拟除虫菊酯类杀虫剂的降解产物测定

1、实验方法

在含有50mlmsm培养基的锥形瓶中加入丙烯菊酯，使其终浓度为100mg/l。接入硝基还原假单胞菌cw-7，以未接菌的为对照，置于30℃恒温摇床中200rpm连续培养7天，每天定期取样，使用乙酸乙酯萃取培养液，应用气相色谱-质谱联用仪(gc-ms)检测丙烯菊酯的降解产物，并根据降解产物化学结构分析降解途径。

gc-ms测定条件如下：gc-ms型号：6890n/5975型(agilent,usa)；hp-5ms石英毛细管柱(30.0m×250μm×0.25μm)；载气：氦气，纯度≥99.999％；流量1.2ml·min-1，不分流进样，进样量均为1μl；电离电压：70ev，选择离子监测(sim)模式；离子源温度：200℃；四级杆温度：150℃；ms传输线温度：280℃；进样口温度：250℃；检测器温度：320℃；升温程序：初温100℃(2分钟)，16℃每分钟升温至200℃(1分钟)，8℃每分钟升温至300℃(5分钟)。

2、实验结果

基于gc-ms的丙烯菊酯的微生物降解结果如图6所示，首先，通过裂解羧酸酯键将丙烯菊酯水解，得到菊酸乙酯、2-环戊烯，4-(羟甲基)-1,1,2,3四甲基。随后，2-环戊烯，4-(羟甲基)-1,1,2,3四甲基被氧化为顺式-2-(2-戊烯基)呋喃。与此同时，菊酸乙酯转化为2,2-二甲基-3-丙烯基-环丙醇。2,2-二甲基-3-丙烯基-环丙醇进一步转化为4-[2,2,6-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮，然后再转化为1,5-己二烯,2,5-二甲基-3-亚甲基，最后顺式-2-(2-戊烯基)呋喃和1,5-己二烯,2,5-二甲基-3-亚甲基均代谢为无毒的小分子化合物，如二氧化碳和水等。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一株硝基还原假单胞菌(pseudomonasnitroreducens)cw-7，其特征在于，该菌株已于2020年6月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmccno：61063。

2.硝基还原假单胞菌在降解拟除虫菊酯类杀虫剂或制备拟除虫菊酯类杀虫剂降解菌剂中的应用。

3.硝基还原假单胞菌在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境中的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述硝基还原假单胞菌为权利要求1所述硝基还原假单胞菌cw-7。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述拟除虫菊酯类杀虫剂为丙烯菊酯、苯氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯、高效氯氰菊酯、氯烯炔菊酯或联苯菊酯中的任意一种或几种。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述自然环境为水体或土壤。

7.一种拟除虫菊酯类杀虫剂降解菌剂，其特征在于，含有硝基还原假单胞菌和/或其菌悬液。

8.根据权利要求7所述的降解菌剂，其特征在于，所述硝基还原假单胞菌为权利要求1所述硝基还原假单胞菌cw-7。

9.一种修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境的方法，其特征在于，用权利要求7或8所述降解菌剂处理自然环境，稀释后的降解菌剂中菌体数量为1.0×105～1.0×109cfu/ml。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，降解工艺条件为：降解温度25～35℃，ph6.0～8.0，拟除虫菊酯类杀虫剂初始浓度为50～150mg/l或50～150mg/kg。

技术总结
本发明公开了一种除虫菊酯类杀虫剂降解菌株及其菌剂和降解工艺。本发明筛选分离得到一株硝基还原假单胞菌CW‑7，该菌株已于2020年6月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：61063。该菌株对降解拟除虫菊酯类杀虫剂具有广谱性，可用于修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的水体、土壤等自然环境，直接施用7天后可使水体和土壤中拟除虫菊酯类杀虫剂残留量降低95％以上；且制备成优良的降解菌剂应用于拟除虫菊酯类杀虫剂污染水体和土壤等环境的生物修复，为农药环境污染的生物修复提供新的微生物资源，丰富了农药降解菌的种质资源库，为开发丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂污染的治理新技术提供理论基础和实践依据。

技术研发人员：陈少华;张文平;潘卡·巴特;黄耀华;张育茗;林子秋;庞诗梅
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2020.07.20
技术公布日：2020.11.06