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底物刚度确定肾上皮细胞中基质基质极化的建立，而不是在小管衍生的细胞中

花匠小妙招
2025-07-28 22:39

1埃因霍温理工大学，生物医学工程系，荷兰埃因霍温2复杂分子系统研究所（ICMS），荷兰埃因霍温3荷兰皇家艺术与科学院Hubrecht研究所，荷兰乌得勒支4荷兰乌得勒支乌得勒支大学医疗中心肾脏学和高血压科

组织形态发生的机械指导是一种新兴的再生医学方法，可用于引导功能性肾脏结构，用于生物人工肾脏设计或肾脏组织工程策略。在肾脏形态发生中，肾上皮细胞的上基底极化对小管形成和随后的组织功能（如排泄和吸收）至关重要。在肾上皮中，偏振是由整合素介导的细胞基质在细胞膜上的粘附开始的。细胞机械生物学研究表明，这种整合素介导的粘附对基质刚度有反应，增加了使用基质刚度作为控制细胞极化的手柄的可能性。在这里，我们评估了麦丁达比犬肾细胞（MDCKs）和由成人肾组织衍生的人类原代细胞建立的管状细胞中不同刚度的2D亚态（1、10、50千帕和玻璃）的基底极化。我们的结果表明，具有低整合素基粘附的亚生理（1 kPa）底物刚度诱导MDCKs的极化，而超生理（>10 kPa）刚度的MDCK保持不极化。事实上，抑制整合素允许在超生理基质上进行极化，这表明在硬基质上增加细胞粘附力与极化相反。相比之下，管状衍生细胞在2D基质上不会建立头-基底偏振，无论基质硬度如何，尽管它们能够在3D环境中极化。进一步分析表明，由于不成熟的局灶粘附和细胞骨架之间缺乏联系，2D培养的管状衍生细胞具有不同的底物刚度时，机械敏感性能力降低。总体而言，这项研究表明，基底极化是一个复杂的过程，其中细胞类型、细胞外环境以及整合素进行的细胞-基质相互作用中的机械和化学方面都发挥了作用。

1 介绍

工程组织被开发用于替换、恢复或增强受损组织或器官的生物功能。哺乳动物肾脏在创建功能性组织结构方面给组织工程师带来了重大挑战，因为肾脏由数百万个管状结构组成，这些结构相互连接，形成一个功能性废物处理系统。此外，这些管状结构是分段的，由具有高度指定过滤和运输功能的异质上皮细胞池组成（O'Callaghan，2016年）。组织形态形成的机械指导是一种新兴策略，旨在创建功能性肾组织结构，用于小管组织工程，以及生物人工肾脏，其中肾上皮细胞播种在二维（2D）生物材料底物上，以允许排泄和吸收。

肾脏形态发生的核心是上皮极化（Jewett和Prekeris，2018年）。上皮细胞极性的特点是极性蛋白的不对称分布，以分离细胞的根部极和基部极（Bryant和Mostov，2008年）。上皮细胞集体中的这种内在不对称性对于将含有液体和根端蛋白的细胞内囊泡向根部膜初始位点进行载体运输至关重要，在那里可以重新创建由这些细胞包围的发光空间（Macara，2004年；Mellman和Nelson，2008年；Sigurbjörnsdóttir等人，2014年）具有中央腔被密封泄漏的偏振上皮细胞包围的管状结构的发展对关键肾功能至关重要，分别包括废物和有用物质的活性和选择性分泌和再吸收（Gullans等人，1996年；Mellman和Nelson，2008年；Kocgozlu等人，2016年）。

早期的细胞生物学研究表明，根部-基底极性的取向是由肾上皮细胞基底部位的整合素介导的细胞矩阵粘附开始的（Wang等人，1990a；Wang等人，1990b；Ojakian和Schwimmer，1994年；Yu等人，2005年；Akhtar和Streuli，2013年）。粘附后，随后的信号级联导致面向基底位点对面的端面的形成（Bryant等人，2010年；Akhtar和Streuli，2013年）。同时，细胞骨架和膜贩运机制组织不对称。细胞骨架细丝，如肌动蛋白和微管，本质上是不对称的极性细丝，有两个不同的末端。放线蛋白聚合在基底膜和顶端膜上都被激活，分别形成一个独特的基底和顶端皮层。抑制Madin Darby犬肾细胞（MDCKs）中的β1-整合素已被证明可以防止三维（3D）体外培养中的极化（Ojakian和Schwimmer，1994年；Yu等人，2005年）。

除了在生化信号传导中的作用外，整合素已被确定为解释所有细胞类型中来自ECM的物理和机械信号的最重要的跨膜受体之一（Yeung等人，2005年；Lock等人，2008年）。整合素与ECM结合导致蛋白质（如塔林、维他林、齐克辛）的招募，这些蛋白质一起形成更大的局灶粘附（FA）复合物。FA复合物通过肌动蛋白细胞骨架与细胞核相连，形成机能转导通路。众所周知，2D底物或3D环境的基质刚性增加会导致粘附细胞中整合素复合物的激活、聚簇和成熟，这些复合物通过改变其细胞骨架组织、张力和细胞形态来响应刚度的变化（Bershadsky等人，2003年；Yeung等人，2005年；Mekhdjian等人，2017年）。结合这两种观察结果，提出了一个问题，即基质刚度是否可以用于控制上皮极化，用于组织工程或生物人工肾脏的发育。

在这里，我们研究是否以及如何利用二维底物刚度来引导肾上皮细胞的基底极化。首先，我们研究了底物刚度对MDCKs中端基底偏振的影响，MDCKs是典型的犬肾体外模型，通常用于端基底极化研究。鉴于我们打算将这项研究得出的见解应用于生物人工肾脏或组织工程，我们接下来研究了底物刚度对人类肾小管蛋白衍生细胞的基底极化的影响，作为人类肾上皮的生理模型。人类小管培养允许长期繁殖供体特异性原发性肾脏上皮，而无需永垂或基因改造。管状体由来自近端小管、Henle环、远端小管和收集管的异质上皮细胞池组成，如使用体积和单细胞转录组学、免疫荧光和功能检测所示（Schutgens等人，2019年）。据报道，随着时间的推移，在培养中和不同捐赠者之间，异质性受到限制，因此预计不会干扰报告的结果（Schutgens等人，2019年；Gijzen等人，2021年；Jamalpoor等人，2021年）。

两种细胞类型都培养在2D胶原蛋白-I涂层聚丙烯酰胺（PAA）基质上，具有亚生理刚度（1kPa）和超生理刚度（10，50千帕），以及涂层和无涂层玻璃盖片作为对照。这种设置允许在不改变化学粘附成分的情况下改变刚度，并通过已知对胶原蛋白I的偏好确保β1-整合素的特定激活（Humphries，2000年）。为了评估极性，我们研究了顶端-基底极化的三个标志性特征：用物种特异性标记适当定位顶端蛋白，皮质肌动蛋白的形成和细胞高度增加（Meder等人，2005年；Bryant和Mostov，2008年；St Johnston和Ahringer，2010年；Shen等人，2011年）。此外，我们通过研究β1-整合素的分布，以及比较β1-整合素阻断抗体的存在和不存在的极化，来研究β1整合素对极化的影响。

材料和方法Madin Darby犬肾细胞培养

Madin Darby犬肾脏II细胞（MDCK-II，ECACC，荷兰）在Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM；Merck，德国达姆施塔特）的标准细胞培养培养培养箱（37°C，5%CO2）中培养和扩张，辅以5%的胎儿牛血清（FBS；Greiner Bio-one，Alphen aan de Rijn，荷兰），1%青霉素（Invitrogen，Waltham，MA，美国）和1%的l-谷氨酰胺。培养基每3-4天更新一次，当达到80%的融合时，细胞通过。细胞在聚丙烯酰胺底物和玻璃底物上播种，密度为5000细胞cm-2，用于免疫荧光分析。为了用AIIB2（爱荷华大学，爱荷华城，美国爱荷华州）治疗细胞，将抗体以2µg mL-1的最终浓度添加到培养基中。实验被复制成三份（n = 3）。

管状文化

管状培养物是如前所述建立和培养的（Gijzen等人，2021年）。实验得到了乌得勒支大学医学中心医学伦理委员会的批准，并事先获得了患者的知情同意。如前所述，小管蛋白被解离为单细胞（Gijzen等人，2021年）。简而言之，在1 mg ml-1 dispase II（Thermo Fisher Scientific，Waltham，马萨诸塞州，美国）37°C下培养管状体30分钟，以去除基底膜凝胶。然后用火焰抛光的巴斯德移液器清洗、剪切小管，并在37°C下用10μM Y-27632 Rho-Kinase抑制剂（Abmole，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）在阿库扎酶（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州）中培养。45分钟后，实现了单细胞悬浮液。细胞被清洗并用Trypan Blue计数。先进的DMEM-F12中的50.000小管衍生细胞，含有1%青霉素/链霉素、1%的GlutaMax和1%的HEPES（ADMEM-F12+++；来自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific的所有试剂）被镀到含有玻璃或1、10或50千帕聚丙烯酰胺基质的12孔培养板上。在16、24、48小时和5天后，这些不同底物上的小管蛋白衍生细胞被清洗两次，用4%的对甲醛固定30分钟，清洗两次，并储存在4°C进行免疫荧光分析。实验被复制成三份（n = 3）。

聚丙烯酰胺基材制备

100微米厚的聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶培养基质由第一个功能性玻璃基质与7%的结合硅烷溶液（PlusOne Bind-Silane；德国达姆施塔特默克）制造。磷酸盐缓冲盐水（PBS；默克，德国达姆施塔特）、40%的丙烯酰胺（Bio-Rad，Veenendaal，荷兰）和2%的双丙烯酰胺（Bio-Rad，Veenendaal，荷兰）以不同的重量百分比混合，以获得Young氏模量中的品种（图1B）。聚合是通过添加10%的过硫酸铵（APS；Bio-Rad，Veenendaal，荷兰）和N，N，N′，N'-四甲基二胺（TEMED；德国达姆施塔特）在室温下持续60分钟（RT）开始的。对于将ECM蛋白与水凝胶交联，将150 µl的1 mg ml−1 Sulfosuccinimidyl 6-（4′-azido-2′-nitrophenylamino）己酸盐（磺酸桑帕；默克，德国达姆施塔特）放置在所有基质表面，并在5厘米的距离的366纳米波长下暴露在紫外线（UV）光下照射10分钟（Camag，16W）。然后将基质（包括玻璃基质）转移到无菌培养柜中，并用无菌PBS冲洗三次。接下来，将100 µl的0.1毫克ml-1鼠尾胶原蛋白I溶液（荷兰阿姆斯特丹康宁）放在底物顶部，并在4°C下孵化过夜。孵化后，在细胞培养之前，用无菌PBS冲洗胶原蛋白涂层的PAA底物3次。使用PIUMA纳米压痕（Optics11，荷兰阿姆斯特丹）用纳米压痕对PAA衬底的杨模量进行了量化。

图1。在具有不同刚度的基底上培养时，MDCK极化和形态学。（A）用于检查不同基底刚度对建立端基底极化的影响的实验设置。（B）使用纳米压痕验证了衬底的杨模量。（C）在弹性模量为1、10和50千帕的PAA基材上或玻璃控制上培养的MDCKs的代表性荧光图像。细胞被染色为podocalyxin（红色）、肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）。共聚焦部分以xy（顶部）和xz（底部）方向显示。秤杆是20µm。（D/E/F）使用专用的Matlab脚本在16小时（D）、24小时（E）和48小时（F）时间点（每组n = 3）对MDCK的细胞高度进行量化。（p值使用Kruskal-Wallis测试和邓恩多重比较测试计算，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）

免疫荧光染色

种子播种后16、24和48小时后，用3.7%的甲醛溶液（德国默克、达姆施塔特）在PBS中固定15分钟，并用PBS清洗三次。细胞随后在PBS中用0.5%的Triton-X-100（德国达姆施塔特默克）渗透5分钟，并在PBS中用10%的马血清在RT中阻断1小时，以防止非特异性抗体结合。然后，用表1中列出的初级抗体在PBS的4°C下用1%的马血清过夜染色。用PBS洗涤三次后，细胞在PBS中用继发抗体培养1小时。细胞用PBS洗涤三次，随后在PBS中用4′-6-二胺-2-苯基吡哈溶液（DAPI）培养。细胞最终用PBS清洗了三次，并用Mowiol（德国达姆施塔特默克）安装。使用油-63倍放大倍率的徕卡SP8显微镜获取了每种条件约10-20个细胞簇的图像，并使用反卷积软件进行进一步分析（荷兰希尔弗瑟姆的惠更斯）。

表1。使用过的抗体和染料列表。本表中使用的缩写：SA，Sigma Aldrich；BD，Biosciences；MI，Merck Millipore；GT，Gene-Tex；TF，Thermo-Scientific。

细胞高度定量

细胞高度是使用定制的Matlab脚本（版本2019b，Mathworks Inc.，美国加利福尼亚州波托拉谷）从免疫荧光共聚焦图像中确定的。简而言之，每个集群2-3个细胞的高度由细胞基部与其最高点之间的距离决定。然后对这些距离进行平均，以确定每个集群一个高度。根据每个复制品的条件，选择并分析了大约10-20个细胞集群。

统计分析

所有数据都表示为平均±标准差。使用夏皮罗·威尔克测试测试了数据的正常性。由于部分实验组没有正常分布，随后进行了Kruskal Wallis测试，然后进行了Dunnett多重比较测试，以确定实验组和玻璃对照组之间的统计学显著差异（GraphPad，加利福尼亚州拉霍亚，美国）。当p < 0.05时，差异被认为是具有统计学意义的。

结果和讨论在MDCKs中建立Apical-Basal极化是机械敏感的

为了研究基质刚度对二维体外模型中基底-基底极化的影响，我们在具有不同弹性模量的胶原蛋白-I涂层基质上培养了MDCKs（图1A）。细胞簇在1、10和50千帕的底物上培养（图1B），代表亚生理（1千帕）和超生理（10和50千帕）刚度（Handorf等人，2015年）。胶原蛋白-I涂层和未涂层的玻璃盖条被用作控制。肾部生理刚度以下的1千帕的底物被证明在MDCK中诱导具有明显凋基极分化的长方体形态。在肾脏生理刚度上方的基质上培养的MDCKs（10 kPa，50 kPa PAA基质和玻璃盖片）上没有表现出任何极化特征。

为了表征根基极化，我们染色了Podocalyxin（PCX）作为MDCKs中广泛使用的犬根茎膜蛋白标记物（Ojakian和Schwimmer，1988年；Cheng等人，2005年），以及用phalloidin的actin细胞骨架，并使用共聚焦显微镜可视化这些标记。从共聚焦图像中，我们使用专用的Matlab脚本量化了细胞高度。在1千帕基质上，PCX在24小时后完全定位到细胞簇的边界（图1C）。此外，MDCK在1kPa底物上显示皮质性皮质演员组织和细胞高度增加（图1D，E，F）。48小时后，在细胞簇中观察到同样的反应，由于增殖导致细胞数量增加，这表明极化稳定。在10和50 kPa底物以及玻璃控制的情况下，MDCK在整个培养过程中在细胞质中表现出均匀分配的PCX（图1C），以及扁平细胞形态（图1D，E，F）。在较硬的底物上生长的所有细胞中，观察到皮质和腹侧肌动蛋白丝的形成有所增加。最后，在涂层和未涂层玻璃基底上培养的细胞之间没有观察到各极性读数的差异（补充图S1）。

其他在不同二维基质上种植MDCK的研究报告了彼此不一致的发现。Kaliman等人（2014年）还调查了在胶原蛋白-I涂层0.6 kPa PAA底物上生长的MDCKs与玻璃覆盖物相比的形态和增殖差异，并发现与我们的研究相比，形态特征存在相同的差异。然而，没有从免疫组织化学上研究端-基底极化的建立（Kaliman等人，2014年）。相比之下，Mrozowska和Fukuda.的研究报告称，MDCK能够采用长方体形态，并在48小时内在无涂层玻璃上偏振（Mrozowska和Fukuda，2016年）。使用多孔支撑的研究，如transwell过滤器[∼3 GPa（Larsson和Dérand，2002）]，表明MDCK具有长方体形态和偏振标记的局部表达。与非多孔支架相比，在多孔支架上生长的细胞的分化和基底极分化增强，这可以通过在基侧表面获得营养物质来解释。然而，在涉及多孔支撑的研究中，没有调查刚性的作用（Lipschutz等人，2001年；Vinaiphat等人，2018年）。

MDCKs中Apical-Basal极化的机械敏感性由β1-Integrins介导

众所周知，β1-整合素是极化的关键媒介，因为MDCKs中β1-整合素的功能中断导致在3D环境中预防囊肿极化（Ojakian和Schwimmer，1994年；Yu等人，2005年；Taddei等人，2008年；Myllymäki等人，2011年；Akhtar和Streuli，2013年）。为了了解β1整合素在基底刚度依赖性根基极化建立中的作用，我们研究了不同底物上MDCKs中β1整合素的定位（图2A）。亚生理底物的整合素主要局限于细胞-细胞边界，而超生理底物的整合素在整个细胞质中更弥漫。在玻璃底物上培养时，细胞还表现出β1-整合素的清晰聚类。加上形态学的差异，整合素的位置和聚类表明，亚生理底物允许减少细胞粘附，从而采用建立极化所需的长方体形态。

图2。MDCK极化取决于β1-整合素受体的表达和位置。（A）在具有可变弹性模量的基质上培养的MDCKs中β1-整合素表达的代表性荧光图像。细胞被染色为β1-整合素（红色）和细胞核（蓝色）。（B）在具有可变弹性模量的底物上培养的MDCK细胞的代表性荧光图像，将β1-整合素抑制剂AIIB2添加到培养基中，最终浓度为2 µg mL−1。细胞被染色为podocalyxin（红色）、肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）。共聚焦部分以xy（顶部）和xz（底部）方向显示。秤杆是20µm。

基于这些发现，我们在培养过程中以2微克ml-1的最终浓度将AIIB2抑制抗体添加到培养基中，从而抑制了整合素（粘着）功能。我们观察到，超生理底物上的MDCK现在能够在24小时内极化（图2B）。在生长在1kPa和10kPa底物上的MDCK中，PCX立即定位在细胞簇的边界（图2B-16 h）。结合皮质肌动蛋白组织和细胞高度的增加，细胞在相对较早的时期就表现出明显的极化特征。50 kPa基材和玻璃盖唇上的MDCKs也在细胞簇的边界上显示了PCX定位，尽管在较晚的时间点（图2B-24 h）。此外，此时此刻，细胞簇中只存在皮质动蛋白，没有测量细胞高度的变化。虽然10kPa和50千帕以及玻璃底物上的MDCK随着时间的推移具有相同的形态和极化特征，由于增殖导致细胞数量增加，但1千帕基底上的细胞表现出垂直增殖（相互叠加）而不是水平增殖（单层形成）（图2B-48小时）。

相比之下，3D培养物的研究表明，抑制β-整合素可以防止极化。我们假设，2D和3D环境之间对β1-整合素抑制的反应差异可以用β1整合素在极化过程中的对立作用来解释。一方面，通过整合素受体的信号级联对于启动顶端-基底极化是必要的（Wang等人，1990a；Wang等人，1990b；Ojakian和Schwimmer，1994年；Yu等人，2005年；Akhtar和Streuli，2013年）。另一方面，整合素与底物的锚固，随着底物刚度的增加而增加（Gallant等人，2005年），与细胞的扩散形态有关，从而对极化产生抑制作用。在我们的实验设置中，生长在超生理基质上的细胞的细胞粘附性增加可能比参与根基底偏振的整合素介导信号通路上占主导地位。在3D培养中，扩散形态对极化的抑制作用并不存在，大概是由于2D和3D细胞粘附之间的差异（Harunaga和Yamada，2011年）。我们关于β1-整合素竞争作用的假设表明，与组织工程肾小管（3D）相比，成功建立生物人工肾脏（2D）的极化可能需要不同的策略。

管状衍生细胞不会表达基底极化的所有特征，并且对机械不敏感

接下来，我们在不同的二维底物上播种了从原发性人类肾上皮建立的管状细胞，以研究MDCKs中发现的极化机制是否转化为原发性人类上皮细胞。（图3A）（Schutgens等人，2019年；Yousef Yengej等人，2020年；Gijzen等人，2021年）。由于PCX在人类中主要由足细胞表达，因此不是细胞极化的适当物种间标记（Uhlén等人，2015年），我们染色了顶端蛋白Crumbs3（Crb3）和紧结相关蛋白质Zona Occludens 1（ZO-1），作为人类上皮细胞顶端-基底极化的特定标记。在整个培养过程中，所有小管细胞簇都表达了Crb3和ZO-1，从而显示了这些小管衍生细胞的上皮性质（图3B，C）。然而，在整个培养期间，所有底物上的小管蛋白衍生细胞中都没有Crb3明显的上定位。以ZO-1为标志的紧密结点在所有条件下都沿着侧膜在基部和基部排列，而不是像生理上皮极化那样只定位在侧膜的基端（Balkovetz，2009年）。管状衍生细胞确实显示了偏振上皮细胞预期的长方体形态。此外，肌动蛋白细胞骨架的组织在培养期间保持不变，细胞底部有F-肌动蛋白纤维和独特的肌动蛋白细胞皮层。我们没有观察到不同块的输卵管细胞之间存在任何差异，这表明不同管状细胞类型之间有类似的反应。

图3。管状衍生细胞在具有不同弹性模量的基质上的极化和结形成。（A）示意图描绘了从人类皮质肾脏分离的管状衍生细胞的培养。（B，C）在弹性模量为1、10和50千帕的PAA基质上或玻璃基质上培养的管状衍生细胞的代表性荧光图像。细胞被染色为Crb3（红色）、肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）或Zona Occludens 1（品红）和细胞核（蓝色）。共聚焦部分以xy（顶部）和xz（底部）方向显示。秤杆是20µm。

为了阐明观察到的极化特征之间的对比，我们再次调查了β1-整合素的定位（图4A）。细胞在β1-integrins作为底物刚度的函数的定位方面没有明显的变化。整合素在整个细胞质中扩散，在细胞-基质边界上没有显示任何聚类，但确实在细胞-细胞边界上表现出一些定位。管状衍生细胞中β1-整合素的存在表明，这些细胞可以通过整合素介导的信号通路进行极化。此外，立方体形态学和细胞骨架的皮质组织都表明，细胞粘附增加所带来的抑制作用在小管衍生细胞中不存在，因此无法解释根茎蛋白和紧密连接的随机定位。这些观察结果表明，其他因素可能导致在二维底物上的管状衍生细胞中建立基底极化。我们可以争辩说，不同细胞类型的研究标记使比较复杂化，特别是因为MDCKs是远端管状上皮细胞，而小管状细胞包含来自其他片段的上皮细胞，包括Henle环和收集导管。此外，这些干细胞衍生细胞建议在3D环境中功能更好，因为之前有报道，3D培养中的输卵管含有带有皮质肌动蛋白细胞骨架的长方体上皮，并表现出纤毛和功能性运输蛋白的极化表达（Schutgens等人，2019年；Gijzen等人，2021年）。在这种3D培养中，细胞在基底膜凝胶中培养，基底膜凝胶由多种ECM成分组成，如胶原蛋白I、胶原蛋白IV和几种层粘连蛋白。因此，这些基底膜凝胶更类似于管状ECM的生理结构和组成。2D培养对体内环境的不准确复制已被证明对干细胞无益（Lv等人，2017年），小管蛋白衍生细胞也可能如此。此外，在这项研究中，我们选择了胶原蛋白-I涂层，因为我们特别关注β1-整合素和通过Rac1的根基极化之间的已知联系（O'Brien等人，2001年；Yu等人，2005年）。然而，根基极化也可以由不同的整合素异二聚体介导。例如，当胶原蛋白通过α1β1、α2β1或α11β1激活Rac1时，层压素倾向于激活α3β1和α6β1。Myllymäki等人（2011年）证明，在3D胶原蛋白-I凝胶中，α2β1-和β4-整合素是诱导极化和随后的流明形成所必需的，而在BME凝胶中，需要激活α3β1。此外，培养的持续时间也可能是肺上皮细胞的一个因素，Szymaniak等人（2015年）表明，从小鼠气管分离的祖细胞在10天后出现极化。因此，未来的研究应进一步探索不同生理相关ECM涂层（如层压板、胶原蛋白IV）的影响以及培养时间，并将实验设置扩展到3D，以更类似于体内情况。

图4。MDCKs和管状衍生细胞根据基底刚度显示机械传感器机械的不同组织。（A）在具有可变弹性模量的基质上培养24小时的管状衍生细胞中β1整合素表达的代表性荧光图像。细胞被染色为β1整合素（红色）和细胞核（蓝色）。（B）图形插图显示通过动态链接作用的机械转导通路，FA复合物在整合素和肌动蛋白细胞骨架之间形成。（C）免疫荧光图像显示24小时后红色（vinculin）和绿色（F-actin）细胞骨架的成熟和组织差异。秤杆是20µm。

此外，采用相同的细胞形态和细胞骨架的皮层组织，无论底物的刚度如何，意味着小管衍生的细胞可能无法感知机械线索。为了理解这一点，我们进一步探索了将整合素与FA复合物和细胞骨架联系起来的机械转导途径，使细胞能够对来自环境的机械线索做出反应（图4B）。我们染色了作为重要FA蛋白的维菌素，并再次染色了肌动蛋白，使用phalloidin来可视化与肌动蛋白细胞骨架的联系（图4C）。在玻璃上生长的MDCKs中，整个细胞中存在大量突出的藤素簇，肌动蛋白纤维组织成连接到FA簇的厚束。在1千帕底物上生长的MDCK中，这种组织是不同的，其中万林均匀地分布在细胞质上，细胞表达皮质细胞骨架，只有有限的基础肌动蛋白。FA和肌动蛋白细胞骨架的组织适应不同的刚度表明，MDCK能够感知二维底物的刚度，并能够做出相应的反应。对于小管衍生的细胞，没有观察到它们因二维底物刚度变化而在文库林和肌动蛋白纤维的分布上的差异。在所有情况下，Vinculin都分布在整个细胞的小簇中，这些簇中的很大一部分没有与放线蛋白纤维共定位。此外，肌动蛋白细胞骨架以典型的干细胞方式组织，具有独特的肌动蛋白皮层和大量的基底肌动蛋白（补充图S2）（Evans等人，2009年；Boraas等人，2016年）。在两种基质刚度上的管状衍生细胞中，机械感化机械的组织在5天内没有改变（补充图S3）。FAs和肌动蛋白细胞骨架之间缺失的联系可能反映了小管培养中成人肾干/祖细胞的存在，因为所看到的细胞骨架（补充图S2）和未成熟的局灶粘连类似于心脏祖细胞的组织（Mauretti等人，2016年）。不幸的是，我们无法与祖上皮细胞进行比较，据我们所知，还没有专门研究干细胞衍生上皮细胞中的机械传感机制。

结论

总之，我们发现MDCKs在亚生理（1 kPa）上建立了端-基底极化，而不是在超生理（>10 kPa）基质上建立了基极化。发现MDCK的极化能力不仅取决于已知的通过β1-整合素进行的生化信号级联，而且在底物刚度增加的情况下，β1整合蛋白介导的细胞与底物的粘附力可以被推翻。软底物和β1-整合素的抑制都消除了与极化竞争的粘附力。另一方面，人类小管衍生细胞在任何被调查的二维底物刚度上都没有完全偏振，而是在所有底物上都表现出相同的长方形态和皮质肌动蛋白细胞骨架组织，这表明机械感能力下降。进一步的分析确实显示了未成熟的FA，其中一部分与细胞骨架无关。总之，这项研究表明，极化是一个复杂的过程，其中细胞类型、细胞外环境以及整合素介导的细胞-基质相互作用的化学和机械方面起着作用。进一步探索极化的潜在机制，以了解不同的因素，将促进生物人工肾脏和肾脏组织工程策略的制定进展。未来的研究还应包括向3D体外模型扩展，以调查极化对基质刚度的影响是否与2D相当，以及如何将这些知识应用于生物工程和/或生物人工肾脏的直接分化、极化和细胞组织。

数据可用性声明

支持这项工作中结论的原始数据包含在文章/补充材料中。任何对原始数据的合理要求都可以发送给相应的作者。

作者贡献

MJH、SL和CVB构思了这项研究。MJH和FAY进行了实验。MJH分析了数据并准备了数字。MJH、FAY、MCV、MBR、SL和CVB撰写了手稿。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

出版商注释

本文中表达的所有主张仅为作者的主张，不一定代表其附属组织或出版商、编辑和评论者的主张。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的索赔，都不得到出版商的保证或认可。

致谢

作者感谢Serena Buscone、Sylvia Dekker和Carola Ammerlaan在样品制备和分析方面的协助，以及Janine Grolleman在基质制备方面的协助。作者进一步感谢“再生医学跨越国界”（RegMed XB）合作伙伴的支持，该合作伙伴由Health ∼ Holland、Top Sector Life Sciences和Health提供支持，以及荷兰教育、文化和科学部对引力计划024.003.013“材料驱动再生”的支持。

补充材料

本文的补充材料可在线找到：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2022.820930/full#supplementary-material