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毛竹PheWRKY11

花匠小妙招
2025-07-30 19:53

毛竹phewrky11
‑
2基因在调控植物抗旱性和耐盐性中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及毛竹phewrky11
‑
2基因在调控植物抗旱性和耐盐性中的应用。

背景技术：

2.毛竹(phyllostachys edulis)是禾本科(gramminales)竹亚科(bambusoideae)刚竹属(phyllostachys)散生竹种，在涵养水源、固土固沙、生物质能源开发等方面有巨大潜力，属于建筑用材中一种非木质资源的优良竹种，是重要的生态、经济和文化资源。然而，世界范围内的高温干旱问题是制约竹林生产的主要逆境因子。竹类植物在生长过程中需要充足的水分，尤其是笋的形成和生长，与水分供应十分密切。干旱严重影响了竹子的产量和质量。因此，进行竹种改良，培育抗旱性强的竹子新品种非常必要，也是扩大竹子分布范围，实现南竹北移的一种重要的途径。而研究逆境条件下毛竹体内相关基因的功能则是进行新品种培育的分子基础工作，对于揭示竹子的抗逆分子机制，进而突破常规育种的局限性，加快竹子育种进程具有重要的现实意义。

技术实现要素：

3.本发明的目的是提供毛竹phewrky11
‑
2基因的应用。
4.具体地，本发明提供以下技术方案：
5.第一方面，本发明提供毛竹phewrky11
‑
2蛋白、其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在调控植物抗旱性中的应用。
6.优选地，所述调控植物抗旱性为提高植物抗旱性。
7.phewrky11
‑
2基因参与毛竹干旱胁迫应答，干旱胁迫可诱导该基因的表达，且过表达phewrky11
‑
2基因可提高植物的抗旱性。
8.第二方面，本发明提供毛竹phewrky11
‑
2蛋白、其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在调控植物耐盐性中的应用。
9.优选地，所述调控植物耐盐性为提高植物耐盐性。
10.phewrky11
‑
2基因参与毛竹盐胁迫应答，盐胁迫可诱导该基因的表达，且过表达phewrky11
‑
2基因可提高植物的耐盐性。
11.第三方面，本发明提供毛竹phewrky11
‑
2蛋白、其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在植物抗旱性或耐盐性遗传育种中的应用。
12.优选地，所述遗传育种为选育抗旱或耐盐植物。
13.第四方面，本发明提供毛竹phewrky11
‑
2蛋白、其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在制备抗旱或耐盐转基因植物中的应用。
14.第五方面，本发明提供毛竹phewrky11
‑
2蛋白、其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在调控植物在干旱条件下的生长或根系发育中的应用。
15.优选地，所述调控植物在干旱条件下的生长或根系发育为促进植物在干旱条件下
的生长或根系发育。
16.第六方面，本发明提供毛竹phewrky11
‑
2蛋白、其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在调控植物在盐胁迫条件下的生长或根系发育中的应用。
17.优选地，所述调控植物在盐胁迫条件下的生长或根系发育为促进植物在盐胁迫条件下的生长或根系发育。
18.本发明所述的毛竹phewrky11
‑
2蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
19.优选地，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
20.本发明采用如下方法克隆得到phewrky11
‑
2基因：
21.⑴
以毛竹叶、茎、根和花的不同组织为材料提取总rna，并将提取得到的总rna反转录为cdna。本发明中，毛竹总rna的提取采用本领域常用的提取细胞总rna的方法即可，本发明的实施例中具体采用trizol法。
22.⑵
在提取得到毛竹总rna后，将所述总rna反转录合成cdna。在本发明中，cdna的合成采用本领域常规的cdna合成方法即可，无其他特殊要求；本发明的实施例中具体采用promega公司的cdna合成试剂盒进行cdna的合成。
23.⑶
在得到cdna之后，进行phewrky11
‑
2基因的pcr扩增，得到目的片段。本发明中，phewrky11
‑
2基因pcr扩增的体系优选为20μl体系，包括10
×
pcr buffer 2.0μl，2.5mm dntp mix 2.0μl，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，cdna模板2.0μl，la taq dna polymerse 0.2μl，ddh2o 11.8μl。pcr扩增反应程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s；95℃退火30s；72℃延伸1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。
24.用oligo7软件设计引物扩增phewrky11
‑
2基因。引物序列如下：
25.上游引物：5
′‑
atgtcttctggacgacgag
‑3′
；
26.下游引物：5
′‑
tgttgggcattgtggaag
‑3′
。
27.⑷
pcr扩增得到目的片段后，将所述目的片段进行测序，得到phewrky11
‑
2基因。在pcr扩增后优选对目的片段进行纯化，对于纯化的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的dna纯化试剂盒进行即可。
28.⑸
纯化完成后，优选将所述纯化后的目的片段连接到pgem
‑
teasy载体，导入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，经菌落pcr验证为阳性克隆后进行测序。
29.本发明所述的生物材料为选自重组dna、表达盒、载体、宿主细胞、植物组织、植物中的任意一种。
30.其中，所述载体包括但不限于转座子、质粒载体、病毒载体；所述宿主细胞为微生物细胞、植物细胞。
31.本发明所述的植物包括毛竹、拟南芥。
32.第七方面，本发明提供一种提高植物抗旱性或耐盐性的方法，该方法包括：提高所述植物中毛竹phewrky11
‑
2蛋白的表达量；所述毛竹phewrky11
‑
2蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
33.优选地，所述提高植物中毛竹phewrky11
‑
2蛋白的表达量为利用基因工程手段，在植物中过表达毛竹phewrky11
‑
2基因。
34.所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：
35.1)通过导入具有所述基因的质粒；
36.2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；
37.3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；
38.4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；
39.5)通过导入增强子。
40.本发明中，携带有所述目的基因的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中。
41.进一步地，采用农杆菌介导法将毛竹phewrky11
‑
2基因转入到拟南芥植株中，获得该基因过表达的转基因植株。
42.优选地，将毛竹phewrky11
‑
2基因构建到植物表达载体pcambia2300上，转化农杆菌，然后浸染拟南芥花序，筛选转基因植株。
43.在本发明的一个具体实施方式中，植物表达载体pcambia2300
‑
phewrky11
‑
2的构建方法如下：
44.以反转录合成的cdna为模板，进行pcr反应，在phewrky11
‑
2基因的上、下游分别引入ecori和hindiii酶切位点；将扩增产物连接到pgem
‑
t easy载体，转化dh5α感受态细胞，进行序列测定；提取质粒，经kpni和bamhi双酶切的pewrky11
‑
2基因片段与pcambia2300
‑
camv35s连接，转化，提取质粒，进行序列测定，植物表达载体pcambia2300
‑
phewrky11
‑
2构建完成。
45.转基因拟南芥的制备方法如下：
46.将构建的植物表达载体pcambia2300
‑
phewrky11
‑
2转化农杆菌菌株gv3101感受态；选取阳性克隆摇菌，花序侵染及纯合子种子筛选；提取拟南芥阳性苗叶片rna，反转录成cdna，用引物phewrky11
‑2‑
f、phewrky11
‑2‑
r进行pcr鉴定。
47.第八方面，本发明提供一种植物育种方法，其为采用所述提高植物抗旱性或耐盐性的方法制备得到的转基因植物进行植物育种。
48.所述育种的方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
49.本发明的有益效果在于：本发明首次揭示了毛竹phewrky11
‑
2基因的生物学功能，通过构建phewrky11
‑
2基因表达载体，结合农杆菌介导的遗传转化法，异源转化拟南芥，考察phewrky11
‑
2对转基因拟南芥抗逆性的影响，并同时检测phewrky11
‑
2对毛竹干旱、盐和激素胁迫的响应，为毛竹转基因研究提供有力工具，为毛竹抗性分子育种提供有价值的候选基因。
附图说明
50.图1为本发明实施例2中phewrky11
‑
2基因克隆pcr产物电泳图(a)以及pcambia2300
‑
phewrky11
‑
2酶切产物电泳图(b)；其中，a中泳道1
‑
2为pcambia2300
‑
phewrky11
‑
2的pcr产物，b中泳道1
‑
3为pcambia2300
‑
phewrky11
‑
2的酶切产物，m为dna marker。
51.图2为本发明实施例4中phewrky11
‑
2基因在不同年龄的毛竹叶片中的相对表达量，其中，a：不同年龄毛竹叶片中phewrky11
‑
2基因相对表达量；b：同株毛竹新叶和老叶中phewrky11
‑
2基因相对表达量。
52.图3为本发明实施例4中phewrky11
‑
2基因在盐胁迫(200mmol/l nacl处理)的毛竹
根、茎和叶中的相对表达量，其中：a：根；b：茎；c：叶。
53.图4为本发明实施例4中phewrky11
‑
2基因在干旱胁迫(20％peg6000处理)的毛竹根、茎和叶中的相对表达量，其中，a：根；b：茎；c：叶。
54.图5为本发明实施例4中phewrky11
‑
2基因在不同激素处理的毛竹根、茎和叶中的相对表达量，其中，a：aba处理；b：sa处理；c：meja处理；d：iaa处理。
55.图6为本发明实施例5中转phewrky11
‑
2基因t3代拟南芥和野生型拟南芥7d大小幼苗在不同胁迫处理下的表型分析，其中，wt为野生型拟南芥，l1、l2和l3分别为不同的转基因植株。
具体实施方式
56.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw，molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
57.实施例1毛竹pewrky11
‑
2基因的克隆
58.以毛竹叶片为材料，按照trizol rna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书方法提取叶片总rna，取1ng rna按照反转录试剂盒(promega，usa)反转录成cdna，用rnase消化cdna产物。根据毛竹基因组数据库http://www.forestrylab.org/db/phepacbio/extractseq/phe/index.php，用oligo7软件设计引物扩增phewrky11
‑
2基因。
59.上游引物：5
′‑
atgtcttctggacgacgag
‑3′
；
60.下游引物：5
′‑
tgttgggcattgtggaag
‑3′
。
61.聚合酶链式反应：
62.20μl反应体系：10
×
pcr buffer 2.0μl，2.5mm dntp mix 2μl，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，cdna模板2.0μl，la taq dna polymerse 0.2μl，ddh2o 11.8μl。
63.pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。
64.回收产物连接到pgem
‑
t easy载体，转化dh5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌斑pcr检测，阳性克隆进行测序(上海生工生物工程公司)，测序结果准确无误。phewrky11
‑
2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
65.实施例2植物表达载体pcambia2300
‑
phewrky11
‑
2的构建
66.设计引物进行聚合酶链式反应，在目的基因phewrky11
‑
2的上下游分别引入kpni和bamhi双酶切位点，产物连接到pgem
‑
t easy载体(promega公司)，转化dh5α感受态细胞，进行序列测定，提取质粒，经kpni和bamhi双酶切的phewrky11
‑
2基因片段与经同样的酶酶切的pcambia2300
‑
camv35s载体连接，转化，提取质粒，进行序列测定。
67.上游引物phewrky11
‑2‑
f：
[0068]5′‑
ggggtaccatgtcttctggacgacgag
‑3′
；
[0069]
下游引物phewrky11
‑2‑
r：
[0070]5′‑
cgggatccagtacccaacaacccgtaacac
‑3′
。
[0071]
⑴
以毛竹叶片cdna为模板进行pcr反应
[0072]
20μl反应体系：10
×
pcr buffer 2.0μl，2.5mm dntp mix 2μl，上游引物1.0μl，下
游引物1.0μl，cdna模板2.0μl，la taq dna polymerse 0.2μl，ddh2o 11.8μl。
[0073]
pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。
[0074]
⑵
扩增产物回收及连接
[0075]
回收片段连接到pgem
‑
t easy载体，转化dh5α感受态细胞，进行序列测定，测序结果准确无误。
[0076]
⑶
表达载体pcambia2300
‑
camv35s
‑
phewrky11
‑
2的构建
[0077]
用kpni和bamhi双酶切连接有phewrky11
‑
2片段的pgem
‑
teasy(图1)，与kpni和bamhi双酶切的表达载体pcambia2300
‑
camv35s(promega公司，美国)构建重组质粒，酶切体系如下(50μl)：
[0078][0079]
37℃酶切4h；产物经过琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(axygen)回收质粒pcambia2300
‑
camv35s大片段和phewrky11
‑
2小片段。用t4 dna连接酶连接两个回收产物，连接反应体系如下(20μl)：
[0080][0081]
4℃过夜连接反应，将连接产物全部转化dh5α感受态细胞。37℃过夜培养，挑选单克隆，菌落pcr验证后，扩大培养，提取质粒pcambia2300
‑
phewrky11
‑
2，进行测序和酶切验证(图1)，植物重组表达质粒构建成功。
[0082]
实施例3植物表达载体pcambia2300
‑
phewrky11
‑
2转化拟南芥
[0083]
⑴
冻融法转化农杆菌gv3101菌株
[0084]
将1ng重组表达载体质粒，加入100μl感受态细胞gv3101中，冰浴10min后，将感受态细胞在液氮中速冻5min，迅速转移至37℃恒温水浴锅中水浴5min,后放置冰上5min，于离心管中加入600μl的lb液体培养基，在28℃摇床中震荡培养2
‑
3h，复苏菌体。吸取60μl菌液涂布在含有kan抗性(50mg/ml)和rif(50mg/ml)抗性的yep固体培养基中，于28℃恒温摇床中倒置平板培养2
‑
3d左右，至长出白色菌落。挑取单克隆菌落pcr检测后，选取阳性克隆摇菌培养。
[0085]
⑵
拟南芥花序浸染
[0086]
将上述阳性克隆接种于10ml yep(50μg/ml利福平+100μg/ml卡那霉素)液体培养基中，28℃培养箱震荡培养(160rpm)12h，取2ml培养液转移至200ml yep(50μg/ml利福平+
100μg/ml卡那霉素)中，进行大量培养，28℃培养箱震荡培养(160rpm)12h，培养液浓度od
600
达到1.8
‑
2.2μg/ml，取50ml培养液，用50ml离心管，4℃5000rpm离心5min，用转化液(ms 2.2g，5％蔗糖，调ph至5.8，加0.2％silwetl
‑
77混合)剧烈悬浮，将沉淀稀释至1.0μg/ml。制备200ml左右，以备浸染拟南芥。将刚开花的拟南芥地上部浸泡于转化液中3min，用保鲜膜包裹植株，暗培养12
‑
16h后，去除保鲜膜，将植株置于培养箱中培养，待采收种子。
[0087]
⑶
纯合子筛选
[0088]
将t0代拟南芥种子置于离心管中，加1ml 70％酒精消毒5min后，再用2.6％次氯酸钠溶液1ml，消毒10min，然后用无菌水清洗5遍。将种子均匀播种于筛选培养基上1/2ms+100mg/l卡那霉素，经4℃低温纯化2d后置于人工气候培养箱中培养至长出4片子叶，将绿色的、正常生长的阳性植株移栽至土壤中栽培，待成熟后分单株收取t1代种子，应用同样的方法筛选t1代幼苗，统计t1代各株系阳性植株与非阳性植株的比例，并将比例约为3:1的株系的阳性植株移栽至土壤中培养，获得t2代种子。应用同样方法筛选t2代幼苗，获得t3代种子。
[0089]
⑷
阳性植株的pcr鉴定
[0090]
提取阳性拟南芥叶片rna，反转录成cdna，用引物phewrky11
‑2‑
f、phewrky11
‑2‑
r进行pcr鉴定。发现阳性植株中均含有phewrky11
‑
2，表明phewrky11
‑
2成功转入拟南芥。
[0091]
实施例4干旱、盐和不同激素胁迫下毛竹phewrky11
‑
2基因表达量分析
[0092]
⑴
材料处理
[0093]
毛竹种子采集于广西壮族自治区，置于恒温光照培养箱中，昼夜温度是25℃/18℃，光周期为光/暗16h/8h，培养至三个月左右，用200mm nacl、20％peg 6000、水杨酸、茉莉酸甲酯、脱落酸和生长素分别模拟高盐、干旱和不同激素胁迫，分别取处理后0h、3h、6h、12h、24h的幼嫩的主根和须根以及相同部位的叶片，在液氮中迅速冷冻，
‑
80℃冷冻保存。
[0094]
⑵
cdna模板的合成
[0095]
利用trizol reagent试剂提取毛竹实生苗根、幼茎及叶片中的总rna，使用无rna酶的dnase i(tiandz)去除基因组dna，用紫外分光光度计测量a
260
与a
280
的比值及rna浓度，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测28s rrna、18s rrna和5s rrna扩增条带的亮度和完整性，通过promega公司的反转录试剂盒合成cdna第一条链，合成产物置于
‑
20℃冰箱保存。
[0096]
⑶
实时荧光定量pcr
[0097]
通过实时荧光定量pcr(qrt
–
pcr)，检测目的基因表达情况。tip41基因作为内参基因，引物如下：
[0098]
tip41
‑
f：5'
‑
aaaatcattgtaggccattgtcg
‑
3'，
[0099]
tip41
‑
r：5'
‑
actaaattaagccagcgggagtg
‑
3'；
[0100]
phewrky11
‑
2的引物如下：
[0101]
phewrky11
‑
2 5
‑
f:5'
‑
cttcacgcccaatgtgc
‑
3'；
[0102]
phewrky11
‑
2 5
‑
r:5'
‑
ggaggagggggtatactcg
‑
3'。
[0103]
10μl反应体系如下：
[0104][0105]
反应程序：95℃1min；95℃10s，62℃10s，72℃20s，45个循环。
[0106]
其他反应参数均为系统默认设置，每个反应设置3个生物学重复，用roche480仪分析数据，利用2
‑
δδct
法分析3次生物学实验数据，用excel进行作图。
[0107]
⑷
实验结果与分析
[0108]
通过实时定量pcr实验对phewrky11
‑
2基因的表达模式进行分析，结果表明，在不同的组织器官中，各个基因的表达模式存在明显的差异；在同株毛竹不同年龄的叶片中，wrky基因表达量在老叶中明显高于新叶，但随着整体植株的衰老基因表达量无明显变化趋势(图2)；在盐胁迫下，phewrky11
‑
2基因表达量在根和茎中均呈现诱导上调(图3)；在干旱胁迫下，phewrky11
‑
2在茎中均呈现上调表达，phewrky11
‑
2在根部受到诱导表达量上调(图4)；在不同激素(iaa、meja、aba、sa)处理下，phewrky11
‑
2基因均受到不同程度上调或下调表达(图5)。
[0109]
实施例5转phewrky11
‑
2基因拟南芥的抗旱性和耐盐性分析
[0110]
在不同浓度的干旱(甘露醇)和盐(nacl)处理下，观察转基因拟南芥植株的表型。将转phewrky11
‑
2基因的拟南芥种子播种在50mmol/l和100mmol/l的甘露醇和nacl培养基上，发现转基因植株须根的数量明显比野生型多，根的长度也明显长于野生型，植株的整体长势明显比野生好。说明过表达phewrky11
‑
2基因能提高转基因植株的抗旱性和耐盐性，phewrky11
‑
2基因在调控植物抗旱和耐盐方面有重要作用(图6)。
[0111]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。