Cultivation of Panax notoginseng in forestland alters the soil microbial community
李京豪, 黎建强, 高朗, 周云. 林下三七种植对土壤微生物群落的影响[J]. 微生物学通报, 2024, 51(6): 1995-2012.
LI Jinghao, LI Jianqiang, GAO Lang, ZHOU Yun. Cultivation of Panax notoginseng in forestland alters the soil microbial community[J]. Microbiology China, 2024, 51(6): 1995-2012.
林下三七种植对土壤微生物群落的影响
李京豪 , 黎建强 , 高朗 , 周云
西南林业大学生态与环境学院, 云南 昆明 650224
收稿日期: 2023-11-11; 接受日期: 2024-01-07; 网络首发日期: 2024-03-04
基金项目: 昆明市科技“揭榜挂帅制”项目(2021JH002)；云南省科技重大专项计划(202102AE090042-03)；云南省兴滇英才支持计划青年人才专项(XDYC-QNRC-2022-0205)；国家自然科学基金(32060345)
摘要: 【背景】 目前，林下三七种植对林地土壤的理化性质及其土著微生物群落结构和功能产生影响的研究比较匮乏。开展林下三七种植对土壤微生物群落影响的研究将对林下三七种植产业发展具有重要的科学指导意义。【目的】 分析林下不同生长期的三七种植地在雨季、旱季的土壤微生物群落变化特征，阐明林下土壤微生物群落对于三七种植过程的响应规律及其关键影响因子。【方法】 选择未种植三七的人工自然林地土壤为对照，以不同生长期的三七种植林地土壤为研究对象，运用高通量测序技术和生物化学分析方法，对林下三七种植过程中林地土壤微生物群落的动态变化进行研究，并在此基础上采用冗余分析法分析土壤微生物群落变化的驱动因子。【结果】 自然对照林地和三七种植林地土壤中优势细菌种群以变形菌门(Proteobacteria)为主，优势真菌种群以担子菌门(Basidiomycota)为主，并且有益微生物门和属的相对丰度都呈现增加趋势。自然对照林地中土壤真菌和细菌特有属的个数最少，而两年生三七种植林地土壤真菌和细菌特有属的个数最多，三年生三七种植林地土壤Chao1和ACE指数最高；主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA)结果显示，三七种植林地土壤微生物组成的分布区范围随着种植年份的增加出现偏移，且分布圈范围呈逐年缩小趋势；相较于雨季，旱季土壤微生物组成的分布范围整体表现为更紧密的特征。冗余分析(redundancy analysis, RDA)表明，土壤中全磷和酸性磷酸酶是影响三七种植林地土壤微生物群落变化的主要驱动因素。【结论】 林下三七种植过程显著改变了种植地土壤微生物的组成，随着种植年份增加微生物组成分布的范围表现出了逐步偏移和收缩的趋势，雨旱季交替加速了三七种植林地土壤微生物群落组成与结构的分化过程。全磷和酸性磷酸酶是影响土壤微生物群落的主要环境因子。
关键词: 三七 林下种植 微生物群落 高通量测序 环境因子
Cultivation of Panax notoginseng in forestland alters the soil microbial community
LI Jinghao , LI Jianqiang , GAO Lang , ZHOU Yun
School of Ecology & Environment, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China
Received: 11-11-2023; Accepted: 07-01-2024; Published online: 04-03-2024
Foundation item: This work was supported by the Kunming Science and Technology "List of Commander-in-chief" Project (2021JH002), the Science and Technology Major Special Program of Yunnan Province (202102AE090042-03), the Xingdian Talent Support Program for Young Talent Special Project of Yunnan Province (XDYC-QNRC-2022-0205), and the National Natural Science Foundation of China (32060345)
Abstract: [Background] The knownledge is limited about the effects of Panax notoginseng cultivation in forestland on the physicochemical properties of the soil and the structure and function of the soil microbial community. Studying such effects will be of great significance in guiding the cultivation of P. notoginseng in forestland. [Objective] To analyze the soil microbial communities in the forestland cultivated with P. notoginseng for different years during the rainy and dry seasons, and to elucidate the response patterns of soil microbial communities to the P. notoginseng cultivation process as well as the key influencing factors. [Methods] The natural forestland soil without P. notoginseng cultivation was taken as the control. High-throughput sequencing and biochemical tests were carried out to reveal the dynamics of soil microbial communities in the soil of the forestland with P. notoginseng cultivation. Based on the results, the redundancy analysis was then performed to clarify the drivers of the microbial community changes. [Results] The dominant bacteria and fungi in the soil of the forestland with and without P. notoginseng cultivation were Proteobacteria and Basidiomycota, respectively. The abundance of beneficial microbial phyla and genera showed an increasing trend. The number of unique genera of fungi and bacteria in soil was the lowest in the control, while it was the highest in the forestland with two-year P. notoginseng cultivation. The Chao1 and ACE indexes were the highest in the forestland with three-year P. notoginseng cultivation. The results of the principal coordinate analysis showed that the microbial distribution area in the forestland with P. notoginseng cultivation shifted and shrank with the increase in cultivation years. The soil microbial community composition was more similar among different groups in the dry season than in the rainy season. The redundancy analysis showed that total phosphorus and acid phosphatase were the main soil factors driving the changes of soil microbial communities in the forestland with P. notoginseng cultivation. [Conclusion] P. notoginseng cultivation in the forestland significantly changed the microbial community composition in the soil, and the microbial distribution presented a gradual shift and contraction with the increase in cultivation years. The alternation of rainy and dry seasons accelerated the composition and structure differentiation of the soil microbial communities in the forestland with P. notoginseng cultivation. Total phosphorus and acid phosphatase were the main environmental factors affecting the soil microbial communities.
Keywords: Panax notoginseng forestland cultivation microbial community high-throughput sequencing environmental factors
微生物是土壤中最活跃的部分之一，是土壤分解系统的主要成分，在推动土壤物质转换、能量流动和生物地化循环中起着重要作用[1]。土壤微生物通过各种生态功能和代谢过程紧密联系在一起，驱动土壤中关键生态过程和生物化学反应，维持着土壤生态系统的稳定。土壤微生物与植物之间的相互作用构成了土壤生态系统中重要的生态过程，其复杂性和多样性在维持土壤健康和促进植物生长方面具有关键作用[2]。
三七[Panax notoginseng (Burkill) F. H. Chen]是五加科人参属多年生草本植物，是我国西南地区特有的道地名贵药材，主要用于治疗心脑血管疾病[3]。云南省作为主产区，种植面积和产量约占全国的98%以上[4]，但三七种植连作障碍突出[5]，且种植需占用大量耕地资源，与粮食作物竞争土地，潜在导致耕地资源枯竭。林下三七是利用林下生物间“相生相克”和林下生态环境与三七生长环境的需求相耦合的原理，让三七回归山野林下，实现三七在林下标准化、规范化和规模化的生产，建立药效第一的药材种植模式。林下种植三七可以减缓三七种植与粮食用地之间的矛盾[6]，同时林地中拥有较高的生物多样性，能更好地优化三七种植环境进而实现三七生态种植[7]。
植物种植会导致土壤环境的变化，包括种植区域中的微环境[8]、土壤养分[9]和植物根系分泌物[10]等方面，植物的进入会显著影响当地土壤微生物群落的结构和功能[11]。植物生长过程中通过根系来释放根系分泌物和根系残留物等有机物质，作为周围土壤微生物的碳源和能量来源[12]。这些有机物质可以增加微生物的数量和活性，促进微生物的生长和繁殖[13]。植物种类的变化和引入，为微生物提供了多样化的生境，生境的变化有利于特定微生物的代谢，进而形成独特而复杂的微生物群落[14-15]。微生物群落组成和结构的改变又会间接促使土壤酶活性的变化[12]，最终使土壤微生态环境发生变化而对植物生长产生影响[16]。林下三七种植改变了林下物种或植物群落组成，可能对土壤微生物产生影响。
林下三七种植尚处于起步阶段，现有研究集中于基因表达[17]、生长品质[18]和种植区分析[19]等，缺乏关于林下三七种植对林地土壤微生物群落组成、多样性的影响及机制的系统研究。因此，本研究以自然林地为对照，以林下三七种植林地为研究对象，基于高通量测序技术和生物化学分析方法，通过对自然对照林地和不同生长期林下三七种植林地雨季和旱季土壤微生物群落组成和结构特征的对比分析，对林下三七种植对土壤微生物特征的影响规律进行研究。并在此基础上，通过对土壤理化性质及土壤酶活性特征的测定，对微生物特征与土壤理化性质的关系进行研究，分析三七种植过程中土壤微生物特征变化的影响因素，为林下种植对土壤功能的影响评估提供科学依据。
1 材料与方法1.1 试验地概况
试验地位于云南省临沧市临翔区博尚镇小道河林场(23°43′16″N, 100°7′3″E)。研究区属于亚热带山地季风气候，存在明显的雨季和旱季，研究区海拔为2 210 m，土壤为红壤酸性土。年平均降雨量为1 254 mm，且多集中于5−12月，日照充足，温差较大，年平均气温为14.68 ℃，最高气温37.06 ℃，最低气温2.53 ℃。试验区主要乔木为云南松(Pinus yunnanensis)近熟林，郁闭度为0.7，平均树高为17.5 m，平均胸径为27 cm。林下灌木主要有金丝桃(Hypericum monogynum)、西南木荷(Schima wallichii)、南烛(Vaccinium bracteatum)，草本植物主要有香茶菜(Isodon amethystoides)、紫金泽兰(Ageratina adeno phora)、竹叶草(Oplismenus compositus)等。
在三七的种植过程中，首先对林地进行清理，清除枯落物层，去除杂草、杂木和树根等；随后使用小型旋耕机对土壤进行翻耕，翻耕2−3次，深度通常在20 cm；三七对土壤水分的需求较为特殊，过多的水分可能引发病害，因此需要修建种植垄。种植垄通常沿等高线布置，垄宽约为135 cm，垄间距为115 cm。
将在苗圃培育的1年生三七苗，在12月初至次年1月中下旬以10−15 cm的株行距移植至提前整理好的垄面，移植后在垄面覆盖一层约2.5 cm厚的松针。三七在林下种植培育时间为2年。
1.2 试验设计和采样方法
本试验以自然林地(CK)作为对照，以两年生三七种植林地(BP)和三年生三七种植林地(TP)为研究对象。分别于2022年雨季和旱季在自然对照林地(RCK, DCK)、两年生三七种植林地(RBP, DBP)、三年生三七种植林地(RTP, DTP)采集土壤样品，所有样品均来自0−20 cm土层，共采集42个土样。采样前对采样工具进行高温灭菌处理，采集后土壤装入无菌密封袋，−20 ℃冰箱中保存并且迅速带回实验室。将采集的土样分为2份，一份用于土壤微生物群落特征测定；另一份风干后进行研磨、过筛，用于土壤理化性质和酶活性的测定。
1.3 主要试剂和仪器
土壤微生物DNA抽提试剂盒(QJ磁珠)，Qiagen公司。NanoDrop 2000超微量分光光度计，Thermo Fisher Scientific公司；MiSeq高通量测序仪，Illumina公司；生化培养箱，天津泰斯特公司；火焰光度计，上海仪电公司；紫外分光光度计，北京普析通用公司；连续流动分析仪，SEAL Analytical公司。
1.4 土壤理化性质和酶活性的测定
土壤pH采用电位法测定(土: 水质量比为1:2.5)；有机质(soil organic matter, SOM)采用重铬酸钾外加热法测定；速效磷(available phosphorus, AP)用氟化铵溶液浸提，采用钼锑抗比色法测定；速效钾(available potassium, AK)用乙酸铵溶液浸提，采用火焰光度计进行测定；土壤微生物量碳(microbiomass carbon, MBC)和微生物量氮(microbiomass nitrogen, MBN)使用氯仿熏蒸浸提后分别采用重铬酸钾氧化-外加热法和紫外分光光度计测定[20]；全氮(total nitrogen, TN)、全磷(total phosphorus, TP)用浓硫酸-过氧化氢消煮后采用连续流动分析仪测定[21]。土壤脲酶(urease, URE)用苯酚钠比色法测定；酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)用磷酸苯二钠比色法测定；过氧化氢酶(catalase, CAT)用高锰酸钾滴定法测定；蔗糖酶(invertase, INV)用3, 5-二硝基水杨酸比色法[22]测定。
1.5 土壤微生物群落测定
根据QJ磁珠说明书进行微生物群落总DNA抽提，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，使用NanoDrop 2000测定DNA浓度和纯度；使用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′)对细菌16S rRNA基因的V3−V4区进行扩增，使用引物ITS1F (5′-CTTGGTCAT TTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R (5′-GCTGCG TTCTTCATCGATGC-3′)对真菌ITS的ITS1区进行扩增。338F/806R的PCR反应体系：5×FastPfu Buffer 4 µL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2µL，上、下游引物(5 μmol/L)各0.8 µL，FastPfu聚合酶0.4 µL，PCR增强剂BSA 0.2 µL，基因组DNA 10 ng，ddH2O补足20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，27个循环；72 ℃ 10 min；10 ℃保存。ITS1F_ITS2R的PCR反应体系：10×rTaq Buffer 2 µL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 µL，上、下游引物(5 μmol/L)各0.8 µL，rTaq聚合酶0.2 µL，PCR增强剂BSA 0.2 µL，基因组DNA 10 ng，ddH2O补足20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min；10 ℃保存。将PCR扩增片段纯化和定量分析后送上海美吉生物科技有限公司进行高通量测序。
1.6 数据处理与分析
使用Fastp 0.19.6[23]进行原始质控，使用FLASH 1.2.11[24]进行拼接，使用USEARCH11中的UPARSE算法[25]进行聚类和去除嵌合体，根据97%的相似性获得OTU。使用RDP classifier 2.13[26]以细菌16S rRNA基因数据库Silva138/16S_bacteria (https://www.arb-silva.de)和真菌ITS基因数据库unite8.0/its_fungi (https://unite.ut.ee)为参照，进行OTU分类学注释。采用mothur1.30.2[27]进行α多样性指数计算，使用Bray-Curtis算法进行主坐标分析(primary coordinate analysis, PCoA)，使用相似性分析(analysis of similarities, ANOSIM)检验样本间微生物群落结构的相似性，并结合PERMANOVA非参数检验分析样本组间微生物群落结构差异显著性。冗余分析(redundancy analysis, RDA)用于分析土壤微生物和环境因子之间的关联性。
采用Excel 2016进行数据整理，采用SPSS Statistics 24.0单因素方差分析(ANOVA, LSD, P < 0.05)对不同处理间的差异进行分析，利用GraphPad Prism 9.5进行绘图。
2 结果与分析2.1 不同样地土壤微生物群落组成
在门分类水平上，变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、绿弯菌门(Chloroflexi)和放线菌门(Actinobacteriota)是自然对照林地和三七种植林地土壤的优势细菌群。不管是雨季还是旱季，自然对照林地土壤中变形菌门和酸杆菌门的相对丰度显著高于三七种植林地，而自然对照林地中绿弯菌门、放线菌门的相对丰度则显著低于三七种植林地(图 1A，表 1)。担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)为自然对照林地和三七种植林地土壤中优势真菌群(图 1B，表 1)。与自然对照林地相比，三七种植林地担子菌门相对丰度显著降低，而子囊菌门相对丰度显著增加。在雨季，被孢霉门相对丰度在自然对照林地和三七种植林地无显著差异，而旱季，三七种植林地被孢霉门相对丰度显著高于自然对照林地。不同优势细菌和真菌菌群在三年生三七种植林地和两年生三七种植林地也存在一定差异性，但在雨季和旱季的变化趋势无明显规律性。
图 1 不同样地土壤中细菌(A)和真菌(B)在门水平上的相对丰度Figure 1 Relative abundance of bacteria (A) and fungi (B) at the phylum level in different soils.表 1 不同样地土壤中细菌和真菌主要菌门占比Table 1 Percentage of major phyla of bacteria and fungi in different soils (%)
处理Treatment 细菌Bacteria 真菌Fungi Proteobacteria Acidobacteriota Chloroflexi Actinobacteriota Basidiomycota Ascomycota Mortierellomycota RCK 40.5 19.5 16.2 12.4 60.5 12.9 20.3 RBP 35.1 13.3 21.1 13.4 43.1 33.7 17.3 RTP 30.7 17.6 21.5 13.8 37.2 39.1 20.0 DCK 36.2 23.8 11.4 14.6 59.6 23.3 8.4 DBP 32.7 18.6 15.0 15.9 47.4 36.9 11.0 DTP 35.3 15.4 15.1 18.8 43.5 41.4 11.4
在属分类水平上，通过组间差异检验找到丰度前15的属，在此基础上选择P值为极显著(P < 0.01)的属, 筛选出的细菌属有分枝杆菌属(Mycobacterium)、草酸杆菌属(Massilia)，主要真菌为红菇属(Russula)、鹅膏菌属(Amanita)、Oidiodendron、Solicoccozyma、Sagenomella、Geminibasidium、unclassified_p__Ascomycota、unclassified_o__Leucosporidiales和Antennariella (图 2)。在这11个特殊属中，其中4个属(Massilia、Amanita、Solicoccozyma和Antennariella)在自然对照林地土壤中相对丰度趋于0 (图 2B、2D、2F、2K)。两年生三七种植林地出现的特有属为Amanita (图 2D)，三年生三七种植林地出现的特有属为Solicoccozyma和Antennariella (图 2F、2K)。
图 2 不同样地土壤细菌与真菌代表性属的相对丰度Figure 2 Relative abundance of representative genera of bacteria and fungi in different soils.A：分枝杆菌属. B：草酸杆菌属. C：红菇属. D：鹅膏菌属. E：Oidiodendron. F：Solicoccozyma. G：Sagenomella. H：Geminibasidium. I：Unclassified_ p__Ascomycota. J：Unclassified_o__Leucosporidiales. K：Antennariella. 不同小写字母表示具有显著差异(Duncan多重比较，P < 0.05)，下同A: Mycobacterium. B: Massilia. C: Russula. D: Amanita. E: Oidiodendron. F: Solicoccozyma. G: Sagenomella. H: Geminibasidium. I: Unclassified_p__Ascomycota. J: unclassified_o__Leucosporidiales. K: Antennariella. Different lowercase letters indicate significant differences (Duncan multiple comparisons, P < 0.05), the same below.2.2 不同样地土壤微生物多样性
2.2.1 不同样地土壤微生物α多样性
将原始测序数据经过拼接、过滤和去除嵌合体后，基于97%的序列相似性划分OTU，共得到细菌OTU 28 756个，隶属于36门111纲255目412科738属1 553种；共得到真菌OTU 33 920个，隶属于14门63纲157目361科810属1 340种。不同处理林地土壤微生物存在特有属，其中雨季自然对照林地中细菌和真菌特有属的数量分别为3个和5个，两年生三七种植林地中细菌和真菌的特有属的数量分别为11个和59个，三年生三七种植林地中细菌和真菌的特有属的数量分别为12个和29个。旱季自然对照林地中细菌和真菌的特有属的数量分别为7个和11个，两年生三七种植林地中细菌和真菌的特有属的数量分别为5个和30个，三年生三七种植林地中细菌和真菌的特有属的数量分别为8个和25个(图 3)。
图 3 不同样地土壤中细菌(A)和真菌(B)特有属的数量Figure 3 Number of endemic genera of bacteria (A) and fungi (B) in different soils.从特有微生物属的数量上来说，与自然对照林地相比，三七种植林地细菌特有属的数量在雨季期间增加2.67倍，在旱季期间降低0.29%，而真菌中的特有属的数量在雨季增加10.8倍，在旱季增加1.73倍。相较于两年生三七种植林地，三年生三七种植林地细菌特有属的数量在雨季期间减少9%，在旱季期间增加0.6倍，真菌特有属的数量在雨季期间减少50.8%，在旱季期间减少16.7%。与雨季相比，旱季自然对照林地中细菌特有属的数量增加1.33倍、真菌特有属的数量增加1.2倍，旱季两年生三七种植林地土壤中细菌特有属的数量减少54.5%、真菌特有属的数量减少49.2%，旱季三年生三七种植林地土壤中细菌特有属的数量减少33%、真菌属特有属的数量减少13.8% (图 3)。
三七种植林地土壤中Chao1指数和ACE指数细菌丰度高于自然对照林地，且随着种植年份的增加出现增长，真菌丰度则在旱季三年生三七种植林地表现较高。多样性指数变化较小，在不同处理下均无显著差异(图 4)。
图 4 不同样地土壤在OTU级别上的丰度和多样性指数Figure 4 Abundance and diversity indices at the OTU level in different soils.A：Chao1指数. B：ACE指数. C：Simpson指数. D：Shannon指数A: Chao1 index. B: ACE index. C: Simpson index. D: Shannon index.2.2.2 不同样地土壤微生物β多样性
为了对林地中的β多样性进行分析，在OTU水平使用Bray-Curtis算法进行PCoA分析，PCoA反映了各个林地中细菌和真菌的差异，PC1和PC2是最主要的特征值，分别可以解释细菌分析结果的24.38%和13.01% (图 5A)，解释真菌分析结果的26.35%和7.24% (图 5B)。从细菌的PCoA结果来看RBP和DBP、RTP和DTP之间结构重叠，RCK和DCK未重叠，并且分区明显，而旱季的DCK、DBP、DTP比雨季表现得更为聚拢。由ANOSIM分析(细菌：R=0.224，P=0.001；真菌：R=0.616，P=0.001) (图 5C、5D)可知，细菌与真菌群落的组间距离显著大于组内距离。
图 5 不同样地土壤细菌和真菌在OTU级别上的PCoA分析和ANOSIM分析结果Figure 5 Results of PCoA and ANOSIM analyses of bacteria and fungi at the OTU level in different soils.A：细菌的PCoA分析结果. B：真菌的PCoA分析结果. C：细菌的ANOSIM分析结果. D：真菌的ANOSIM分析结果A: The results of the PCoA analyses of bacteria community. B: The results of the PCoA analyses of fungi community. C: The results of the ANOSIM analyses of bacteria community. D: The results of the ANOSIM analyses of fungi community.2.3 土壤理化性质与酶活性和优势微生物群的相关性
三年生种植林地土壤全磷含量较两年生三七种植林地含量有所上升且差异显著(P < 0.05)，对比雨季和旱季的养分指标，3个林地中的酸性磷酸酶含量显著增加，且pH随着三七种植、三七年份增长和雨季到旱季的过程中均显著增加(表 2)。
表 2 不同样地土壤理化性质与酶活性Table 2 Physicochemical properties and enzyme activities in different soils
Item 雨季Rainy season 旱季
Dry season RCK RBP RTP DCK DBP DTP pH 4.58±0.16c 4.91±0.21bc 5.21±0.28ab 4.72±0.43c 5.27±0.17ab 5.32±0.15a 有机质SOM (%) 20.78±0.56a 14.36±2.72bc 13.81±1.50c 21.26±0.87a 16.63±1.54b 14.36±1.28bc 过氧化氢酶
CAT (mg/g) 11.61±0.47a 10.13±0.71b 10.51±0.50b 11.97±0.42a 10.54±0.88b 10.40±0.25b 脲酶URE (mg/kg) 1.75±0.06a 0.85±0.36bc 0.96±0.11b 0.56±0.03c 0.16±0.02d 0.97±0.12b 蔗糖酶INV (mg/kg) 4.64±0.62a 2.56±1.13b 2.36±0.98b 2.55±0.34b 0.96±0.12c 1.56±0.68bc 酸性磷酸酶
ACP (mg/kg) 0.74±0.05d 0.64±0.08d 0.89±0.06c 1.63±0.07a 1.50±0.05b 1.46±0.09b 微生物量碳
MBC (mg/g) 0.50±0.01cd 1.20±0.26b 0.31±0.19d 1.56±0.36a 0.58±0.27cd 0.76±0.13c 微生物量氮
MBN (mg/g) 0.12±0.01a 0.10±0.03bc 0.06±0.01d 0.10±0.01ab 0.07±0.01d 0.07±0.01cd 速效磷AP (mg/kg) 9.57±0.26c 21.88±3.89ab 19.26±6.64ab 14.49±0.28bc 25.34±5.67a 22.68±4.92a 速效钾AK (mg/kg) 67.80±1.10b 300.59±58.89a 254.79±20.77a 51.18±0.34b 240.96±97.43a 295.47±94.19a 全氮TN (g/kg) 5.31±0.10ab 4.19±1.19b 4.00±1.26b 5.87±0.54a 4.46±0.70b 4.13±0.57b 全磷TP (g/kg) 0.87±0.01c 0.81±0.13c 1.02±0.10ab 0.94±0.08bc 0.81±0.15c 1.15±0.11a 同一行不同字母标记表示具有显著差异(Duncan多重比较，P < 0.05)
Different letters marked in the same row indicate the significant difference under Duncan’s multiple comparisons at P < 0.05.
利用冗余分析对丰度前5的微生物和土壤环境因子(包括酸碱度、有机质、过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、微生物量碳、微生物量氮、速效磷、速效钾、全氮、全磷)与丰度前5的微生物之间的关系进行了分析。RDA分析表明，不同处理林地土壤中细菌和真菌均存在明显的分化，并且影响其变化的环境因子也存在差异。
针对细菌的RDA分析(图 6A)表明，前2个约束轴(RDA1和RDA2)的解释率分别为24.56%、9.54%，细菌中Acidobacteriales、Subgroup_2和全磷、酸性磷酸酶相关性最高，AD3和速效钾相关性最高，Bradyrhizobium、Xanthobateraceae和有机质、过氧化氢酶、全氮、蔗糖酶的相关性最高。
图 6 不同样地土壤细菌(A)和真菌(B)在属级别上的RDA分析Figure 6 RDA analyses of bacteria (A) and fungi (B) at the genus level in different soils.针对真菌的RDA分析(图 6B)表明，前2个约束轴(RDA1和RDA2)的解释率分别为19.65%和10.29%。真菌Saitozyma、Solicoccozyma、Mortierella和全磷的相关性最高，Sebacina和微生物量氮的相关性最高，Penicillium和酸性磷酸酶的相关性最高。
3 讨论3.1 林下三七种植对林地土壤微生物组成的影响
微生物核心菌群丰度的变化有助于平衡土壤内部激素，促进植株生长，提升植物的抗病性和养分利用率[28]。本研究中优势真菌种群的担子菌门为最大真菌门，子囊菌门的相对丰度次之，与相关研究结果类似[7]。有研究中出现最大真菌占比的为子囊菌门，相对丰度达到56.42%[7]、59.3%[29]，担子菌门仅占23.01%[7]、17.3%[29]，而在大田种植中，出现与葱轮作后子囊菌门达到80%的情况[30]。这可能是因为不同种植方式导致土壤养分含量和环境条件发生改变，从而影响了微生物群落的组成。担子菌门是土壤中重要的分解者，其主要作用是分解植株残体中的木质纤维素[31]进而为土壤中一系列活动提供养分，相关研究中出现担子菌门的相对丰度随土壤含水量的增加而升高[32]。三七种植地的子囊菌门中出现较多病原微生物，有研究推测三七根腐病的发生和子囊菌门丰度增加有关[33-34]。本研究中发现担子菌门相对丰度高于子囊菌门，可能是因为林下三七种植抑制了病原微生物门的增加。
本研究发现，在丰度处于前十五的属中，有2个细菌属和9个真菌属的特异性为极显著。Massilia为有益细菌，可以抑制三七枯萎病病原菌Fusarium的生长[31]。相关研究指出三七在雨季根腐病最为严重[32]，在本研究中发现雨季Massilia丰度较高，到旱季则降低较为明显，Massilia的高丰度期和根腐病发病期重合，在一定程度上可能降低根腐病发病概率。相关研究发现Geminibasidium在三年生三七根际土壤中丰度最高[35]，而在本研究中表现为在两年生三七种植林地中最高，这可能是因为三七种植林地特定年份的土壤条件或营养物质更适合这种真菌的生长和繁殖。本研究表明真菌特异性属的数量变化远大于细菌，说明土壤中微生物组成整体转向了真菌变化主导型，这与相关研究[35-36]的结果相符，出现这种情况是由于真菌在生态适应性的方面通常比细菌更为特化，真菌的菌丝网络可以延伸到更远的距离，从而使得其在土壤中的分布更广泛，这可以为真菌提供更合适的繁殖条件，同时为变异提供了更大可能[37]。
3.2 林下三七种植对林地土壤微生物多样性的影响
由Venn图(图 3B)可以发现，两年生三七林地相对于自然对照林地土壤真菌特有属数量增加10.8倍，雨季中三年生三七林地土壤真菌的特有属数量相对于两年生三七林地减少50.8%，整体趋势为先增加后减少。在群落组成的演变中，以确定性过程为主导，同质性为演变核心，主要受当地特殊环境操控[38]。这种变化可以解释为种植年份的不同阶段存在不同的微生物相互作用机制。初始阶段存在合作效应，新的植物引入可能为微生物提供更多的生存环境和资源，从而增加细菌的多样性和丰度。随着时间的推移，会出现拮抗竞争效应，微生物之间的竞争和抑制关系逐渐加强，导致真菌的变化趋于平稳。
丰度指数(图 4A、4B)表明，在旱季期间，随着种植年份的增长，细菌Chao1和ACE指数都出现了增加。在旱季期间，相较于自然对照林地，三七种植林地真菌的Chao1和ACE指数都出现了增加。在相关研究[35]中，三七种植地中的丰度指数在种植后1‒2年降低、2‒3年增加。也有研究发现丰度指数随年份增加而增加[34]。但是在本研究中并未发现种植时间段和微生物多样性之间有着明显线性关系。丰度指数的增加反映了种植三七后土壤微生物群落组成的改变和适应过程，微生物可能与三七建立了更密切的共生关系。
PCoA分析(图 5)表明，随着年份的变化各组微生物群落可以明显区分，微生物整体分布圈在逐年缩小且出现了偏移的趋势，表明三七种植改变了林地土壤的微生物群落结构。旱季相对于雨季发生了整体性收缩，这表示样本在降维空间中的分布趋于集中，结合图 5中年份之间出现的收缩变化，证明雨旱季交替加速了这种收缩趋势。随着种植三七年份的增长，三七的植物根系会逐渐扩展释放出更多的有机物和化合物，这些根系分泌物可能影响土壤的理化性质，从而改变林地土壤中养分构成[12]。当微生物开始适应与三七相互作用的土壤环境，这个过程会导致微生物群落分布的偏移。连续种植会让微生物逐渐稳定它们的组成和功能[39]，这种稳定进一步加强某些微生物种类在特定环境中的竞争力[40]。部分微生物可能适应新的林地环境并逐渐占据了更适合自身生存的生态位，引发微生物群落的结构发生变化，这导致微生物群落在PCoA图上的偏移距离增大。不同年份微生物之间的生态位重叠程度减少，意味着它们在资源利用和生态角色上变得更加分化[41]。雨旱季的环境变化加快了三七种植中细菌和真菌的演化速度，在这期间发生了微生物群落的重新调整，导致样本间的相似性增加，趋向于形成三七特有微生物群落[7]。
3.3 林下三七种植林地土壤性质与微生物群落的相关性
三七在种植过程中不断与土壤环境发生互作，造就特异的养分和微生物环境[42]。在本研究中，旱季自然对照林地土壤中的pH、速效磷、速效钾的含量显著低于旱季三七种植林地，有机质、过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、微生物量碳、微生物量氮、全氮的含量则高于旱季三七种植林地(表 2)，可以发现三七种植林地土壤中多种养分相对于自然对照林地都降低。本研究发现，自然对照林地土壤中的有机质含量达到21.26%，在三七种植林地土壤中达到16.63%，这与相关研究中的15%−17%[7]的结果近似，远高于大田种植的3.0%−4.5%[43-44]。有机质含量高是因为有机物质从植物、树木的凋落物、落叶和腐殖质进入土壤之后在土壤中分解，可以为不同种类微生物的生长和繁殖提供养分[45]。相关研究表明，土壤养分作为微生物的主要能源物质，能够显著影响微生物群落结构和组成[46-48]。
在不同种植年限的三七种植林地中，土壤微生物群落之间有着较大的差异性[35]。本研究中三年生三七种植林地相对于两年生三七种植林地在雨季的pH值升高6.1%、在旱季pH值升高了1%。相关研究中[44, 49]中发现随着年份的增加pH值呈现降低的趋势，pH值降低会使得土壤酸化，这有利于三七根腐病病原菌的生长，是三七连作障碍的诱因之一[50]。本研究出现这种不同的原因是较为丰富的林下环境构成会延缓养分环境的变化[51]，这些土壤性质和养分状况的变化反映了土壤生态系统在不同年份的种植过程中发生的演化。这一演化与植物生长、土壤养分循环、微生物活动以及其他环境因素相互作用，共同塑造了三七种植林地的土壤生态特征。
降雨能够直接刺激微生物活性和微生物呼吸，促进微生物量积累，但其影响在不同植被类型间存在差异[52]。雨季的降水会导致养分淋失和冲刷到较浅的土层，从而改变土壤中养分的可获得性[53]，降水也会介导土壤中的溶解性物质，使得养分的浓度相对升高[54]。而在旱季条件下，水分稀缺，微生物竞争可能会更加激烈以获取生存所需的磷资源。这种竞争可能促使微生物更加积极地分泌酸性磷酸酶，将土壤有机态磷转化为生物可利用的有效磷[55]来维持其生物活性，这种行为提高了土壤中酸性磷酸酶的活性表达，有助于土壤微生物适应不同季节的生态环境条件。同时RDA分析的结果表明，土壤微生物群落与土壤养分以及土壤酶活性之间存在关联，全磷、酸性磷酸酶是对雨旱季微生物群落影响最大的2个指标。
4 结论
(1) 林下种植三七改变了土壤微生物组成，其中真菌组成的变化远大于细菌，并且增加了有益微生物门和属的丰度，有利于三七生长。
(2) 随着种植年份的增加，微生物分布区间出现偏移，旱季相对于雨季来说微生物分布收缩明显，雨旱季交替加速了微生物群落分化过程。
(3) 林下种植三七可以调节三七植株种植过程中造成的土壤营养不足和土壤酸化问题，环境因子中全磷和酸性磷酸酶是影响土壤微生物丰度的主要因素。
本研究有助于了解林下三七种植对土壤微生物群落和环境因子的影响，为优化土壤管理策略和促进林下三七种植的可持续发展提供了科学依据。
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