豆瓣绿瓶内和瓶外生根的对比探究
摘要：豆瓣绿（Peperomiatetraphylla）是一种常见的观叶植物，并具有较高的药用价值。为提高豆瓣绿繁殖的生根效率我们开展其试管苗瓶内和瓶外生根的比较研究。结果表明，瓶内生根时MS培养基中添加0.1mg/LIBA可以取得最佳的生根率和根系质量；试管苗用100mg/LIBA溶液浸泡30min进行瓶外生根时效果最佳。综合来看，瓶外生根的成活率达95.9%，高于瓶内生根条件下77.1%的移栽成活率，并且瓶外生根可以缩短育苗时间，降低培养成本，更加符合商业化育苗的要求，从而具有更高的发展潜能。
豆瓣绿（Peperomiatetraphylla）是草胡椒属的多年生草本，常丛集而生，因其叶翠绿、宽厚、容易养护而成为一种备受欢迎的观赏植物。豆瓣绿主要分布于四川、云南、贵州、广东、广西等地，全草可入药，具有化痰止咳，舒筋活血，消肿止痛的功效，在传统中药中，常被用来治疗口腔炎、咽喉炎、风湿性关节炎、支气管炎、疮疖肿毒、骨折、跌打损伤、中暑、痢疾、腹泻、疳积，以及胃癌、肝癌、肺癌和乳腺癌等疾病[1,2,3,4]。最近的研究报道从豆瓣绿中分离到具有抗肿瘤作用的药用成分[5,6]。例如，Li等[7]在豆瓣绿植株中提取出一种新型的环丁烷型降木脂素，能够有效地抑制人类前列腺癌细胞的增殖；于大永等[8,9,10]发现豆瓣绿的乙醇提取物可以通过阻断细胞周期，诱导白血病U937细胞凋亡，从而起到治疗白血病的效果，并且还能抑制黑色素瘤A375细胞增殖；Nishanthi等[11]研究发现，利用豆瓣绿的醇提取物可以有效防治乙二醇导致的小鼠尿石症。Shi等[12]在豆瓣绿中提取出了一种叫做PeperobtusinA的酚类化合物，它可以通过依赖性的半胱天冬酶（Caspase）和p38MAPK信号通路诱导U937淋巴瘤细胞凋亡。
很多学者对豆瓣绿的繁殖进行了研究。郝静韦[13]分别利用带叶柄和腋芽的叶片、纵切后留有伤口的叶片以及带腋芽的茎段进行豆瓣绿的扦插研究；赵兰枝等[14]利用豆瓣绿顶端枝条，在不同的营养液和添加不同浓度3-IBA的溶液中进行了水培繁殖实验；王涛等[15]分别用具芽茎段、花序和叶片为外植体，建立了豆瓣绿的组织培养体系；苏平[16]利用豆瓣绿的顶芽，切取茎尖作为外植体，进行了豆瓣绿脱毒苗的培育。目前为止，豆瓣绿的组培体系已经相对完备，但由于成本和技术要求过高，难以应用于大规模的商业化生产，组培苗驯化移栽无法成活等问题也造成了巨大的经济损失。瓶外生根作为一种新兴的生根方式，具有较大的发展潜力，我们在现有的组培体系基础上，将瓶外生根应用于豆瓣绿的繁殖过程中，添加三种植物生长调节剂，进行瓶内生根和瓶外生根的比较研究，并对生根率、生根数目、根长、移栽成活率等指标进行测定，更加直观的比较瓶内生根与瓶外生根两种生根方式的效果差异，为豆瓣绿的商业化繁殖提供更详细的理论依据。
1、材料和方法
1.1无菌苗的培养
1.1.1外植体消毒。
实验用豆瓣绿（Peperomiatetraphylla(Forst.f.)Hook.etArn.）种植在曲阜师范大学温室中，选择健康鲜活的叶片为外植体，用软毛刷清除表面的浮土，再用稀释过的洗洁精水浸泡40min，之后用自来水冲洗1h。然后用75%的乙醇消毒30s后用无菌水冲洗3～5次。最后，使用0.1%升汞溶液添加少量的吐温-20进行消毒，时间为6min，并用无菌水再次冲洗3～5次。
1.1.2外植体接种和不定芽获取。
在前人的基础上，我们使用添加1.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和1.0mg/L激动素（Kinetin,KT）的MS培养基进行初代培养。培养6周后，将叶边缘诱导出的不定芽接种在添加有1.0mg/L6-BA+1.0mg/LKT+0.05mg/L赤霉素（gibberellins,GA3）的MS培养基上进行继代培养。
1.2生根阶段
1.2.1瓶内生根。
在MS培养基中分别添加0.1、0.2、0.3mg/L的吲哚丁酸（indolebutyricacid,IBA），萘乙酸（naphthylaceticacid,NAA),2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-Dichlorophenoxyaceticacid,2,4-D）三种植物生长调节剂（表1）。每培养瓶中接种3个不定芽，每个处理5瓶，重复3次。
1.2.2瓶外生根。
培养后的试管苗从培养瓶中取出并切割成1～2cm至少保留半片叶子的小芽，尽量保证小芽的初始生长状态基本一致。然后，使用无菌水浸泡1h后，在分别添加50、100和200mg/LIBA,NAA和2,4-D的溶液中浸泡30min，蒸馏水对照，然后将小芽插入蛭石：珍珠岩：泥炭（1:1:2）的混合基质中，使用7cm×7cm×7cm的塑料花盆，每盆3个小芽，每个处理5盆，重复3次。每天进行一次浇水并在植物上方覆盖透明塑料盖子保持水分，5周后，盖子以每天2、4、6和8h的时间梯度打开，第6周去掉盖子再培养3d。
1.3培养条件和数据处理
培养基中均添加了30mg/L蔗糖，6.5mg/L琼脂，并将pH调节到5.8～5.9。实验所涉及到的金属器械、玻璃器皿、培养基等经过121℃高压蒸汽灭菌15min备用。
所有的植物放在25±1℃的培养室中，光照强度40～50μmol/m2sPPFD，每天12h光照（灯管型号为：飞利浦40W灯管，NVC照明，中国，惠州）。
1.4数据处理
培养6周后，使用MicrosoftExcel2007记录各处理的生根率，生根系数，根长以及整体生长状态，驯化移栽后，统计移栽成活率。数据用SPSS22.0软件进行方差分析，均值采用Duncan's检验进行多重比较。
2、实验结果
2.1无菌苗的培养
把消毒后的叶片切成1cm2左右大小，并接种在添加有1.0mg/L6-BA和1.0mg/LKT的MS培养基中[15]，培养6周后叶片边缘诱导出大量的不定芽（图1A）。继代培养后，发育成完整的植株（图1B）。
2.2IBA,NAA,2,4-D对瓶内生根的影响
瓶内生根的所有处理均可达到100%的根诱导率（图2A），但是不同处理间根系的生长特征出现了明显的不同（表1）。结果表明，在添加IBA的培养基中诱导出的根细长，分支多，并有少量根毛（图2C），在添加NAA的培养基中生长的根相对较短，但主根上具许多细小分支（图2D），在添加2,4-D的培养基中生长出少量肉质短根，根毛浓密（图2E）。在瓶内生根中，在MS培养基中添加不同浓度的IBA诱导根的长度较长且差异不大，0.1mg/LIBA达到了35.5mm的平均根长，且培养出的植株生长状态良好，移栽后全部成活，0.3mg·L-1IBA可以达到50.9的平均生根数目。综合来看，0.1mg/LIBA在豆瓣绿的瓶内生根中效果最佳（表1，图2A）。经过驯化移栽以后，瓶内生根小苗的综合成活率为73.1%（图2B）。
表1不同浓度IBA,NAA,2,4-D对豆瓣绿瓶内生根的影响
*表中数值代表的是平均值±标准误，同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
图1豆瓣绿叶片诱导不定芽的形成过程
A：叶边缘长出不定芽；B：组织培养得到的豆瓣绿小苗；C：生根处理使用的小芽。
图2不同浓度IBA,NAA,2,4-D对豆瓣绿瓶内生根的影响
A：从左到右分别为IBA(0.1、0.2、0.3mg/L),NAA(0.1、0.2、0.3mg/L),2,4-D(0.1、0.2、0.3mg/L），最左边为MS对照；B：驯化并在土壤中培养3个月的豆瓣绿小苗；C:MS+0.1mg/LIBA;D:MS+0.2mg/LNAA;E:MS+0.3mg/L2,4-D。
2.3IBA,NAA,2,4-D对瓶外生根的影响
瓶外生根的小苗，根系均为纤维状的须根（图3B）。瓶外生根过程中，IBA处理过植株的根系生长的更加健康并且有着更多的分枝，而对照中，植株只能生长出少量细弱的短根（表2）。经过IBA和NAA处理的小苗，与对照2,4-D处理相比，地上部分生长的更加健壮、生命力强（图3A）。瓶外生根过程中，100mg/LIBA浸泡30min是最有效的处理，可以达到9.8的平均生根数和20.3mm的平均根长。瓶外生根后的小苗经过驯化移栽，成活率可达100%。
3、讨论
3.1植物激素对豆瓣绿瓶内生根的影响
生长素在生根的过程中起着关键作用[17]。研究发现，IBA在植物体内可以转化成IAA发挥作用，从而促进根原基的形成、根系的生长和侧根的发育[18,19]。豆瓣绿在IBA的处理下可以达到最佳瓶内生根效果，这与前人在马大杂种相思（Acaciamangium×A.auriculiformishybrids）、杂种蓝莓（Wild×'Blomidon'）等植物中的研究结果一致[20,21]。研究发现，通常植物会改变他们的根毛和根的直径等形态特征以适应不同的生长环境[22]。瓶内生根的豆瓣绿植株与瓶外生根相比，具有根系肉质、根毛更浓密等特点，这可能和试管内特殊的营养条件与微环境有关。
3.2植物激素对豆瓣绿瓶外生根的影响
在瓶外生根过程中，使用100mg/LIBA浸泡30min达到了良好的生根效果。在爬山虎（Parthenocissustricuspidata）的研究中发现，IBA和NAA可以促进爬山虎根系的生长并使其根系有更多的分支[23]。在杉木（Cunninghamialanceolata）的瓶外生根研究中100mg/LIBA溶液浸泡1h效果最佳，生根率可达89.6%[24]。在蝴蝶兰（Phalaenopsisaphrodite）的瓶外生根研究中，使用含不同浓度IBA和NAA的培养液对不同品种的蝴蝶兰进行瓶外生根培养，发现在添加100mg/LIBA的培养液中，生根率可达95%[25]。在石榴（Punicagranatum）的研究中发现，使用1476μM/LIBA处理不定芽的基部5min可以达到85%的生根率[26]。此外，在甘蔗（Saccharumofficinarum）的研究中发现，瓶外生根与瓶内生根相比，能够节省51%的单株成本[27]。研究发现，使用瓶外生根的方式培育10000株马大杂种相思小苗增加收益1288.26元[20]。
表2不同浓度IBA,NAA,2,4-D对豆瓣绿瓶外生根的影响
*表中数值代表的是平均值±标准误，同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
图3不同浓度IBA,NAA,2,4-D对豆瓣绿瓶外生根的影响
A、B：从左到右分别是IBA(50、100、200mg/L),NAA(50、100、200mg/L),2,4-D(50、100、200mg/L),CK为清水对照。
3.3豆瓣绿瓶内生根和瓶外生根的比较
从我们的研究结果来看，瓶内生根得到的根系质量更高，整体生根率可达100%，经过驯化移栽后，瓶内生根的成活率为73.1%；瓶外生根的生根率为95.9%，生根后的植株均能成活，总体而言，瓶外生根的成活率要高于瓶内生根。主要原因是瓶内生长环境具有无菌、恒温、高湿的培养特点，试管苗移栽后不能立即适应外界的栽培环境，而瓶外生根中，生长状态不佳的弱苗在生根过程中逐渐淘汰，移栽成活的小苗已逐步适应了土壤环境[17,28]。在我们的研究中，瓶内生根的小苗生根数目较多，根系较长，多长有白色根毛，但除IBA处理生根的小苗外，整体的根系质量不高，移栽成活率较低，其中经过不同浓度2,4-D处理后的小苗，综合成活率仅为43.7%，原因可能是2,4-D诱导出的肉质短根本身含水量过高，难以适应土壤中更加复杂的营养环境，我们推测这种肉质、增粗的变态短根，其解剖结构已发生了相应的变化，瓶外生根可以减少在驯化移栽时造成的损失，更加适合于豆瓣绿的商业化生产。目前来讲，豆瓣绿的主要繁殖方式为扦插繁殖和组织培养。扦插生根可以节省人力、物力，但通常繁殖周期过长，繁殖过程易受季节和母株限制，繁殖系数低，这种繁殖方式往往不能提供足够多的植株。组织培养技术可以快速地繁殖大量植株，其中，瓶内生根与后期的移栽是组培的关键因素，也是组培苗商业化育苗的重要环节，但瓶内生根通常会面临成本和操作要求过高、驯化移栽的成活率较低等问题，并不能应用于所有的植物[13,17,24,29,30,31,32]。而瓶外生根技术将组织培养技术和扦插生根进行结合，即将组培得到的大量不定芽进行扦插，使植物自养生根，简化了组培瓶内生根程序，降低了操作要求，不仅缩短了育苗周期，降低成本，节省资源，而且提高了移栽成活率，具有很大的发展潜能，值得在组培商业化育苗生根过程中进行推广[17,26,33,34]。
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基金:国家自然科学基金(31700624);曲阜师范大学本科生科研训练计划项目(2019A017).
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