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一种具有抗菌抗炎活性的多肽及其应用的制作方法

花匠小妙招
2025-10-12 14:13

本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种具有抗菌抗炎活性的多肽及其应用。
背景技术：
：抗菌多肽是生物体合成的一类小分子防御多肽，具有广谱杀菌作用，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有较强的杀灭作用，对某些真菌、支原体，尤其对耐药性细菌也都有很好的杀灭作用，是动物固有免疫系统的重要成员。一般的抗生素是通过阻断生物大分子的生物合成来发挥作用，而抗菌多肽可以在细菌细胞膜上穿孔而形成离子性通道，造成细菌细胞膜结构破坏，引起胞内水溶性物质大量渗出，最终导致细菌死亡。随着传统抗生素的广泛使用，许多病原菌已经产生耐药性，因此，活性多肽在抗菌方面就有明显优势。现有技术中，科学工作者们已经从细菌、真菌、高等植物、无脊椎动物、脊椎动物乃至人体中发现并分离获得上千种具有抗菌活性的多肽。比如大豆生物活性多肽lunasin是从大豆中分离鉴定的一个天然多肽，分子量约为5kda，全长43个氨基酸残基，将此基因转染哺乳动物细胞，能阻断有丝分裂并引起染色体断裂，最终导致细胞凋亡，研究表明，lunasin具有抗结肠癌、乳腺癌和前列腺癌的功能，还具有抗炎作用，对巨细胞具有抗氧化作用。然而天然分离的活性多肽lunasin存在含量低、活性较低的缺陷，不利于分离纯化，限制了其应用。技术实现要素：本发明提供的一种具有抗菌抗炎活性的多肽及其应用，对现有多肽lunasin结构进行改进，在细胞中高效表达，易于分离纯化，活性较高。本发明的第一个目的是提供一种具有抗菌抗炎活性的多肽，所述多肽的核苷酸序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示。本发明的第二个目的是提供一种应用权利要求1所述的多肽制备的重组载体，所述重组载体是将如seqidno.1所述的核苷酸序列插入质粒pet-32a(+)中得到的。本发明的第三个目的是提供一种包含权利要求2所述的重组载体的转化体。本发明的第四个目的是提供一种权利要求1所述的多肽在抑制lps引起的炎症反应中的应用。本发明的第五个目的是提供一种权利要求1所述的多肽在抗痤疮丙酸杆菌中的应用。与现有技术相比，本发明提供的一种具有抗菌抗炎活性的多肽及其应用，具有以下有益效果：g-lunasin是对现有多肽lunasin氨基酸结构进行改进，利用第32-37位grdgrd的作用使g-lunasin进入目的细胞核内，提高与目的细胞的结合效率，与天然lunasin相比，促进高效表达，增加生物活性。grdgrd后添加h氨基酸，在不影响多肽活性的基础上，增加其与亲和ni柱的结合效率，便于分离纯化。附图说明图1为凝胶回收后目的基因片段和质粒片段的电泳图谱；其中，m泳道为dnamaker，1号泳道为目的基因片段，2号泳道为质粒片段；图2为阳性克隆经xbai和psti双酶切鉴定图谱；其中，m泳道为dnamaker，1号泳道为双酶切后的空质粒，2号泳道为双酶切后的重组质粒；图3为sds-page电泳检测结果；其中，m泳道为dnamaker，1号泳道为g-lunasin多肽表达产物。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明提供的一种具有抗菌抗炎活性的多肽(下文称g-lunasin)，所述多肽的核苷酸序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示，该多肽是对活性多肽lunasin的氨基酸结构进行改进，在如seqidno.3所示的lunasin氨基酸序列中添加氨基酸残基，增加原有lunasin的活性和在细胞中的表达效率，减少其分离纯化的难度。基于同一种发明构思，本发明还提供了一种g-lunasin的制备方法，包括以下步骤：s1，构建重组载体将如seqidno.2所示的核苷酸序列的一端添加ndei的酶切位点，另一端添加xhoi的酶切位点，得到目的基因，插入到puc57质粒中保存，得到重组质粒puc57-g-lunasin。用ndei、xhoi双酶切重组质粒puc57-g-lunasin，酶切体系如表1所示，酶切条件为37℃，2h，凝胶回收带有g-lunasin核苷酸序列的目的基因片段；用ndei、xhoi双酶切质粒pet-32a(+)，酶切体系如表2所示，酶切条件为37℃，2h，凝胶回收序列较长的质粒片段；图1是凝胶回收后目的基因片段和质粒片段的电泳图谱，其中，m泳道为dnamaker，1号泳道为目的基因片段，2号泳道为质粒片段，条带清晰，无杂带。将目的基因片段和质粒片段经t4连接酶连接过夜，连接体系如表3所示，构建得到重组载体puc57-g-lunasin-pet-32a。质粒pet-32a(+)广泛应用于融合蛋白、多肽的表达，并且带有组氨酸标签等，便于下游多肽蛋白的分离纯化。表1重组质粒puc57-g-lunasin的酶切体系表2质粒pet-32a(+)的酶切体系质粒pet-32a(+)(30ng/μl)40μlndei3μlxhoi2μl10×buffer5μl总体系50μl表3连接体系试剂名称使用量目的基因片段(30ng)6μl10×t4dnaligasebuffer2μl质粒片段(50ng)5μlt4dnaligase(5u/μl)1μlddh2o20μls2，转化，制备表达工程菌将重组载体puc57-g-lunasin-pet-32a的转化入大肠杆菌dh5αde3感受态细胞，选取阳性转化子作为表达工程菌，转化方法采用常规转化方法即可。阳性转化子的筛选也按照常规方法进行。挑取阳性克隆经xbai和psti双酶切鉴定，结果如图2所示，结果显示重组载体构建正确。s3，多肽表达、纯化s31，将表达工程菌接种到lb(amp抗性)培养基中，37℃，220rpm震荡培养过夜，得到种子液，次日将种子液按照2％的体积比例转入新鲜的lb(amp抗性)培养基中，继续培养至od600＝0.6，然后加入iptg，使iptg的终浓度为0.1mm，30℃，220rpm震荡培养4h，得到多肽表达菌液；取多肽表达菌液1ml，5000rpm、4℃离心5min，收集菌体；iptg诱导表达后，表达产物经sds-page电泳检测，结果如图3所示，其中，m泳道为dnamaker，1号泳道为g-lunasin表达产物，6kda附近可见清晰的条带。s32，取1g菌体，加入相当于菌体质量5％的bingdingbuffer溶液a(20mm磷酸盐，0.5m氯化钠，5mm咪唑，ph7.4)和pmsf。pmsf用无水乙醇配制成100mm的储存液，pmsf的工作浓度为1mm。加入bingdingbuffer溶液a和pmsf重悬细胞沉淀，加入溶菌酶(工作浓度为0.3mg/ml)，混匀，冰上放置30min。400w冰上超声破碎细胞，超声5s停5s，反复40次。加入10％tritonx-100，使终浓度为0.05％，混匀，冰上放置15min。12000rmp、4℃离心20min，取上清，并用0.22μm膜过滤上清，得到过滤液，冰上保存备用。s33，将nisepharose树脂装入合适的层析柱，用相当于过滤液10倍体积的洗脱液分离，经bingdingbuffer溶液a(含50mmolnah2po4、5mmol咪唑、500mmolnacl，溶剂为双蒸水，ph至7.4)、溶液b(含50mmolnah2po4、20mmol咪唑、500mmolnacl，溶剂为双蒸水，ph至7.4)、溶液c(含50mmolnah2po4、60mmol咪唑、500mmolnacl，溶剂为双蒸水，ph至7.4)、溶液d(含50mmolnah2po4、100mmol咪唑、300mmolnacl，溶剂为双蒸水，ph至7.4)洗脱，流速为12-15ml/h分别收集洗脱液，经鉴定洗脱液d中g-lunasin的纯度达98.3％％，含量达0.05g/ml，而该方法提取的天然lunasin的纯度为90.3％％，含量为0.03g/ml。一、g-lunasin毒性检测分别配制0、10μm、30μm、60μm的g-lunasin溶液，刺激巨噬细胞raw264.7，加药24h后mtt检测刺激巨噬细胞活性，结果分别为100％、104％、110％、98％，结果表明0-60μm的g-lunasin多肽溶液对巨噬细胞病毒无毒性。二、g-lunasin对细胞培养基中no浓度的影响以无菌水作为阴性对照，24h后检测no细胞培养基质中no产量为2.4μm。以1μg/ml的lps作为阳性对照组，刺激巨噬细胞raw264.7，24h后检测no细胞培养基质中no产量为5.5μm。然后我们分别向4个lps刺激的细胞培养基质中加入10μm、30μm、60μm的g-lunasin溶液、100μm的天然lunasin溶液，24h后检测细胞培养基质中no分别浓度为4.5μm、4.3μm、4.1μm、4.8μm。说明g-lunasin溶液能够显著降低lps引起的no升高现象，具有良好的生物学活性，能够有效抑制lps引起的炎症反应，且g-lunasin比天然lunasin溶液效果更显著。三、g-lunasin抗菌效果于大鼠耳廓中央给予痤疮丙酸杆菌菌悬液50μl皮内注射成功构建大鼠痤疮模型后，痤疮模型a组不给予任何治疗；b组皮损处给予克林霉素0.1％溶液外用治疗；c组皮损处给予质量分数0.05％g-lunasin溶液外用治疗。对照组不注射大鼠耳廓中央给予痤疮丙酸杆菌菌悬液。三组大鼠注射部位皮肤于注射24h时开始增厚，并逐渐增加，于第5天出现粉刺、丘疹、脓疱等痤疮样皮损，色红，质硬；b、c组处理2周后，脓肿基本消退，厚度变薄，颜色趋于正常。取各组大鼠右耳部注射部位皮肤组织，he染色发现对照组的大鼠左耳皮肤表皮较薄，可见毛囊，表皮、真皮交界清楚；a组表皮角化过度，毛囊面积扩大，炎性细胞弥漫性浸润；b、c组毛囊角化明显减轻，真皮层可见少量炎性细胞。说明g-lunasin溶液具有良好的抗菌效果。b、c组大鼠未观察到毒副反应。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。序列表<110>河南工程学院<120>一种具有抗菌抗炎活性的多肽及其应用<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>141<212>dna<213>人工序列<400>1tccaaatggcagcaccagcaagacagctgccgcaagcagctccagggggtgaacctcacg60ccttgcgagaagcacatcatggagaagatccaaggccgcggcggccgcggccacgatgac120gatgatgatgatgacgacgac141<210>2<211>47<212>prt<213>人工序列<400>2serlystrpglnhisglnglnaspsercysarglysglnleuglngly151015valasnleuthrprocysglulyshisilemetglulysileglngly202530argaspglyargasphisaspaspaspaspaspaspaspaspasp354045<210>3<211>43<212>prt<213>大豆<400>3serlystrpglnhisglnglnaspsercysarglysglnleuglngly151015valasnleuthrprocysglulyshisilemetglulysileglngly202530argaspaspaspaspaspaspaspaspaspasp3540当前第1页12