瑞拉菌素产生菌GAO
导 师: 安德荣
学 校: 西北农林科技大学
专 业: 植保资源利用
关键词: 链霉菌 发酵 农用抗生素 效价 大孔吸附树脂 纯化
分类号: TQ920.6
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
为进一步提高瑞拉菌GAO-1-GR-2菌株的效价,对其发酵条件和活性物质的提取工艺进行优化,为工业化生产作了准备。瑞拉菌GAO-1-GR-2菌株是以委内瑞拉链霉菌新变种RL-2 (Streptomyces venezuelaevar. Qinlingensis RL-2)为基础,以链霉菌广泛使用的整合型质粒pSET152和复制型pHZ1358为出发质粒,通过供体大肠杆菌(Escherichia coli) ET12567 (pUZ8002)进行属间接合转移瑞拉菌素产生菌获得的高发酵效价的工程菌株。本实验对瑞拉菌GAO-1-GR-2的发酵条件进行了单因素研究,通过正交试验设计对该菌株的培养基进行了筛选。并对其发酵条件进行了研究,结果表明：有机氮源以酵母粉和黄豆饼粉为宜；碳源以葡萄糖和饴糖最好,但考虑到发酵成本,应选用葡萄糖2%。发酵培养基应呈中性,以采用自然pH为宜,pH超过8,或小于7,则会抑制发酵产物活性；通气量为1：0.5最好,能降低20%耗氧量；摇床转速140r/min,培养温度30℃,发酵周期72h。抗生素发酵原粉效价能达到4000μg/m1。瑞拉菌GAO-1-GR-2活性产物粗提物有较广的抑菌谱,对多种病原菌有较强的抑制作用,尤其对水稻稻瘟、小麦赤霉、小麦根腐、烟草赤星等病原真菌及十字花科软腐等细菌抑制率较高,lmg·L-1药剂浓度的抑制率都在65%以上,这为广谱性生物农药的研制提供了理论依据。以瑞拉菌素高产菌GAO-1-GR-2发酵液为基础,选用不同的粗提温度和5种不同的大孔吸附树脂提取瑞拉菌素高产菌GAO-1-GR-2抑菌活性物质,以稻瘟菌为指示菌,进行吸附条件优化。结果表明,最佳粗提温度为60℃GAO-1-GR-2抑菌活性物质活性最强且提取效率最高,HP-20对活性物质的吸附效果较好,并且获得了较优的吸附条件：上样液pH为6.0,最佳的吸附流速为2.OmL·mi-1,最佳的洗脱液为体积分数50%的甲醇、70%的乙醇和30%的丙酮,洗脱液最佳流速为1.5mL·min-1
全文目录
摘要 6-7
ABSTRACT 7-12
引言 12-13
第一章 文献综述 13-24
1.1 生物农药的研究及应用 13-16
1.1.1 生物农药简介 13
1.1.2 微生物源农药的研究及应用 13-15
1.1.3 动物源农药的研究及应用 15
1.1.4 植物源农药的研究及应用 15-16
1.2 农用抗生素的研究及其产生菌 16-17
1.2.1 农用抗生素的发展历程 16
1.2.2 农用抗生素的产生菌 16-17
1.3 微生物发酵过程 17-20
1.3.1 抗生素发酵有关的参数 17-19
1.3.2 发酵过程的代谢变化 19-20
1.4 抗生素的分离提取 20-23
1.4.1 发酵液的预处理 20
1.4.2 抗生素的提取 20-22
1.4.3 抗生素的精制 22-23
1.5 抗生素的应用前景与发展趋势探讨 23-24
第二章 材料和方法 24-28
2.1 材料 24
2.1.1 菌种 24
2.1.2 供试病原菌 24
2.2 瑞拉菌GAO-1-GR-2发酵条件优化 24-25
2.2.1 摇瓶试验 24
2.2.2 发酵培养基中无机氮源试验 24
2.2.3 葡萄糖代用品试验 24
2.2.4 初始pH的影响 24
2.2.5 通气量试验 24-25
2.2.6 恒温摇床转速对目的菌生长的影响 25
2.2.7 温度对GAO-1-GR-2菌生长的影响 25
2.3 高产菌株GAO-1-GR-2活性物质的提取 25-26
2.3.1 发酵液的预处理 25
2.3.2 有机溶剂溶媒萃取法提取GAO-1-GR-2菌株活性成分 25
2.3.3 大孔吸附树脂在GAO-1-GR-2菌株活性成分提取中的应用 25-26
2.4 活性产物对病原菌孢子萌发的影响 26-27
2.5 抗生素效价的生物测定 27-28
第三章 结果与分析 28-40
3.1 发酵条件的优化 28-32
3.1.1 有机氮源的确定 28-29
3.1.2 发酵培养基中无机氮源试验 29
3.1.3 葡萄糖代用品试验 29-30
3.1.4 初始pH的影响 30
3.1.5 通氧气量试验 30-31
3.1.6 转速对目的菌生长的影响 31-32
3.1.7 温度对GAO-1-GR-2菌生长的影响 32
3.2 高产菌株GAO-1-GR-2活性物质的提取工艺结果 32-33
3.2.1 有机溶剂溶媒萃取法提取GAO-1-GR-2菌株活性成分的结果 32-33
3.3 大孔吸附树脂在GAO-1-GR-2菌株活性成分提取中的应用 33-40
3.3.1 不同浓缩温度对活性物质的影响 33
3.3.2 吸附树脂的选择 33-34
3.3.3 不同pH对HP-20树脂吸附的影响 34
3.3.4 洗脱液筛选结果 34-35
3.3.5 不同浓度稀释液对HP-20树脂吸附的影响 35
3.3.6 吸附流速的筛选结果 35-36
3.3.7 洗脱液流速对解吸的影响 36
3.3.8 GAO-1-GR-2抗真菌活性产物对孢子萌发的影响 36-39
3.3.9 抗生素效价的生物测定 39-40
第四章 结论与讨论 40-43
4.1 结论 40
4.1.1 瑞拉菌GAO-1-GR-2发酵条件的优化 40
4.1.2 瑞拉菌GAO-1-GR-2发酵液活性物质的提取 40
4.2 讨论 40-43
4.2.1 瑞拉菌发酵条件的优化 40-41
4.2.2 关于活性物质提纯方案 41-43
参考文献 43-47
附件 47-50
致谢 50-51
作者简介 51
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