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一种松树与干巴菌形成菌根苗的方法

花匠小妙招
2025-10-13 07:29

本发明涉及共生真菌培养、共生关系的建立与共生真菌苗的移栽存活，具体涉及通过人工侵染松树幼苗根系形成与干巴菌共生的菌根苗的方法。

背景技术：

1、自然界中众多植物的根系可以与细菌、真菌、放线菌中的一些菌类形成具有互利共生关系的联合体，即菌根。外生菌根为菌丝体侵染植物新生根所形成的共生组织，使得菌根菌与其宿主植物交叉共享营养物质(分为共同需要和各自单独需要)，以及共同抵御外界环境变化，形成复杂的互利共生关系。外生菌根上的菌丝在数量和表面积上远大于植物的根毛，可以大幅增强宿主植物对水、矿质营养元素的吸收，进而改善宿主植物的生长状况，并影响宿主植物的土壤微环境。外生菌根可以增强宿主植物的抗逆性，同时菌根菌丝可以缠绕吸附在病原菌菌丝体上，随着菌根菌丝的生长，其产生的溶菌物质可以通过溶解病原菌菌丝、孢子的细胞壁和细胞膜，达到清除病原菌的目的，从而提高宿主植物抗病能力，起到防治病害的作用。

2、松树非共生苗在自然条件下难以成活，依照共生理论发展菌根苗技术，对提高松树幼苗移栽成活率意义重大。有关真菌与松树的菌根合成的研究结果表明，松树共生苗的人工培育难度受到菌根真菌来源、种类等因素的影响，外生菌根对宿主植物的生长效应差异极大(早期真菌与本土和外来松的菌根合成.菌物学报,2022,41(08):1293-1302.)。干巴菌(thelephota ganbajun zang)是担子菌门、革菌目、革菌科、革菌属的大型食用真菌，其子实体丛生、呈珊蝴状、多次分枝。干巴菌在自然界中是与松树存在共生关系的菌根真菌，例如野生干巴菌是珍贵富硒食用菌，属于云南松(pinus yunnanensis franch)外生菌根菌。中国专利cn110463508a公开的人工形成干巴菌菌塘的方法中，建立了松树与干巴菌共生体系，但是受限于干巴菌菌种筛选、培养方面的技术难度，菌塘形成过程较为复杂，容易受到外界环境的干扰而降低侵染效果。中国专利cn112889578a公开的干巴菌菌种的制备方法中，通过分离培养双核菌丝，提高菌种形成子实体的能力，但是对于干巴菌的侵染扩繁及应用并未深入讨论。并且在外生菌根研究中，主要应用孢子悬浮液进行菌根合成，从而达到侵染及获得共生菌根苗的目的。

3、另外，中国专利cn112868450a公开的加快坚果树木生长和发育的方法中，采用了含萘乙酸(naa)、细胞分裂素(ctk)及尿素等成分的处理液对坚果苗木基部进行浸润，促进其生长发育，提高种植成活率，但该处理液还含有愈合剂成分，对侵染菌种不利(真菌侵染的细胞层深度仅为幼嫩的木栓层细胞，可随生长的周期更新，太强和快速的愈合会使侵染层凋落)。而中国专利cn110012835a、cn1922985等中，将蔗糖、谷氨酰胺用作诱导、促进松科植物胚性愈伤组织的形成，但松科植物胚性愈伤组织并不适于直接进行菌根真菌的侵染。

4、目前亟待提出一种利用干巴菌有效侵染松树根系并形成专一菌根苗的技术，其对干巴菌资源的开发利用及松树栽种都有重要的意义和价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种松树与干巴菌形成菌根苗的方法，使通过干巴菌自然侵染形成共生苗的过程可以在人工条件下稳定、高效的实现，从而提高松树幼苗移栽成活率。

2、为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、通过种子萌发或组织培养获得松科植物幼苗，将松科植物幼苗的根系进行机械刮擦，然后将松科植物幼苗的根系浸入干巴菌菌丝培养液中，然后将根系粘附有干巴菌菌丝的松科植物幼苗移至含有琼脂的半固体培养基中进行光照培养，直至松科植物幼苗的根系上形成共生的干巴菌菌丝体，然后依次进行炼苗、大田移栽，得到可供造林使用的松科植物菌根苗。

4、优选的，所述松科植物选自云南松或马尾松。

5、优选的，所述种子萌发包括以下步骤：采用氢氧化钠溶液水解干燥的松科植物种子，待松科植物种子外壳软化后进行化学试剂灭菌，然后对松科植物种子进行促生长培养。

6、优选的，所述水解采用质量分数10％-20％的氢氧化钠溶液，水解温度为10-30℃，水解时间为2-6小时。所述氢氧化钠溶液还可以用于洗涤树脂、杀灭杂菌。

7、优选的，水解前筛除外壳破损的松科植物种子(例如依靠肉眼将外壳有破损的种子拣选出来，外壳破损的种子容易被杂菌侵染，不利于后续培养)。

8、优选的，所述化学试剂灭菌采用的灭菌剂为体积分数5％-10％的双氧水，主要用于杀灭霜疫霉、绿色木霉病原体以及细菌。

9、优选的，所述促生长培养具体包括以下步骤：经过化学试剂灭菌后，将松科植物种子用含0.1％-3％(质量分数)萘乙酸(naa)和0.1％-3％(质量分数)赤霉素的混合水溶液润湿，然后于湿度60％-95％、温度10-30℃下培养30-60天。

10、优选的，所述松科植物幼苗的根系(具体指促生长培养中发育的主根)在长至3-7厘米长度后即可进行机械刮擦，此根系在完成机械刮擦后可以通过干巴菌菌丝的侵染(即侵染是在所述半固体培养基上进行的光照培养过程中发生的)在继续发育的主根和每条侧根上都形成共生的干巴菌菌丝体，这是经自然条件形成的共生苗所不能达到的。

11、优选的，所述机械刮擦具体以在解剖镜下观察到0.5-2毫米长度的创伤为完成标准。

12、优选的，所述干巴菌菌丝培养液是通过对干巴菌菌丝进行液体培养获得的。

13、优选的，所述液体培养的条件包括：温度25-30℃，搅拌转速15-150转/min，培养时间25-30天。

14、优选的，所述液体培养中采用的液体培养基按质量分数计成分如下：1％-5％的谷氨酰胺、1％-5％的天冬氨酸钠、0.5％-2％的蔗糖和3％-14％的玉米淀粉，余量为水(例如水的质量分数为74％-94.5％)。在此培养基条件下，不仅实现了干巴菌菌丝的液体培养，而且通过培养可以形成活力旺盛的菌丝球(在将根系浸入前，仅需通过搅拌即可将菌丝球转变为分散均匀的菌丝)，解决了液体培养中菌丝细弱或者不能培养的问题，并达到最佳的侵染效果。

15、优选的，所述半固体培养基按质量分数计具体包括以下组分：1％-25％的谷氨酰胺、0.1％-25％的天冬氨酸、0.5％-3％的甘油、3％-10％的琼脂和37％-95.4％的水；ph为4.0-6.0；

16、或者，所述半固体培养基按质量分数计具体包括以下组分：1％-25％的谷氨酰胺、0.1％-25％的天冬氨酸、0.5％-3％的甘油、3％-10％的琼脂和37％-95.4％的土壤浸出液；ph为4.0-6.0。

17、优选的，所述侵染中采用的光照培养的条件为：培养温度15-28℃，培养湿度75％-90％，光强2500-6000lux，培养时间36-500小时。

18、优选的，所述炼苗包括以下步骤：在侵染结束后，将未感染杂菌，即在所述半固体培养基上经光照培养后存活的松科植物幼苗移至灭菌营养土，然后进行光照培养。

19、优选的，所述炼苗中采用的光照培养的条件为：培养温度13-25℃，培养湿度85％-95％，光强1000-2500lux，培养至株高5-10厘米。

20、优选的，所述灭菌营养土是通过将以下按质量分数计的原料，即：55％-99％的菌渣和1％-45％土壤(例如红壤)，依次进行混合、厌氧发酵和灭菌而制成的。经过发酵后的菌渣中可被微生物利用的有机物减少，使营养土能够提供稳定土壤环境，有利于菌根苗的成活。

21、优选的，所述菌渣为由果渣、木屑、秸秆等中的一种或两种以上任意比例的组合经培育蘑菇后形成的菌糠。

22、优选的，所述灭菌营养土的原料混合后，先用生石灰调ph至4.5-7.0，再进行厌氧发酵。

23、优选的，所述灭菌营养土采用湿热灭菌。

24、本发明的有益效果体现在：

25、本发明利用可分离培养的纯干巴菌菌种通过液体培养方式快速获得大量干巴菌菌丝，并利用菌丝对经机械刮擦后的松科植物幼苗的根系进行侵染，快速形成松树根系与干巴菌的共生体系，进而获得干巴菌侵染的松树菌根苗。本发明使得侵染后共生苗的存活率达80％-90％，且实现了70％-85％的侵染率。

26、进一步的，本发明依据实验研究中所发现的干巴菌侵染过程中根系汁液外流的现象，以及对根系汁液中有益于干巴菌共生生长并能够促使干巴菌侵染松树幼根的有效成分的分析鉴别，在侵染过程所使用的半固体培养基中补充天冬氨酸、甘油、谷氨酰胺，不仅促进干巴菌生长，而且可以使其更快的侵染松树幼根并建立共生关系，从而更有效的形成菌根苗。